微生物生長(cháng)的測定

微生物生物情況可以通過(guò)測定單位時(shí)間里微生物數量或生物量的變化來(lái)評價(jià)。通過(guò)微生物生長(cháng)的測定可以客觀(guān)地評價(jià)培養條件、營(yíng)養物質(zhì)等對微生物生長(cháng)的影響，或評價(jià)不同的抗菌物質(zhì)對微生物產(chǎn)生抑制（或殺死）作用的效果，或客觀(guān)反應微生物的生長(cháng)規律。因此微生物生長(cháng)的測量在理論上和實(shí)踐上有著(zhù)重要的意義。微生物生長(cháng)的測量有計數、重量和生理指標等方法。

1 ．計數法

    此法通常用來(lái)測定樣品中所含細菌、孢子、酵母菌等單細胞微生物的數量。計數法又分為直接計數法和間接計數兩類(lèi)。

（ 1 ）直接計數

    這類(lèi)方法是利用血球計數板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數量。此法的缺點(diǎn)不能區分死菌與活菌。計數板是一塊特制的載玻片，上面有一個(gè)特定的面積 1mm 2 和高 o .1mm 的計數室，在 1mm 2 的面積里又被刻劃成 25 個(gè) ( 或 16 個(gè) ) 中格，每個(gè)中格進(jìn)一步劃分成 16 個(gè) ( 或 25 個(gè) ) 小格，但計數室都是由 400 個(gè)小格組成。

    將稀釋的樣品滴在計數板上，蓋上蓋玻片，然后在顯微鏡下計算 4-5 個(gè)中格的細菌數，并求出每個(gè)小格所含細菌的平均數，再按下面公式求出每毫升樣品所含的細菌數。

    每毫升原液所含細菌數＝每小格平均細菌數× 400 × l0 000 ×稀釋倍數

(2) 間接計數法

    此法又稱(chēng)活菌計數法，其原理是每個(gè)活細菌在適宜的培養基和良好的生長(cháng)條件下可以通過(guò)生長(cháng)形成菌落。將待測樣品經(jīng)一系列 10 倍稀釋?zhuān)�然后選擇三個(gè)稀釋度的菌液，分別取 0.2ml 放入無(wú)菌平皿，再倒入適量的已熔化并冷至 45 ℃ 左右的培養基，與菌液混勻，冷卻、待凝固后，放入適宜溫度的培養箱或溫室培養，長(cháng)出菌落后，計數，按下面公式計算出原菌液的含菌數：

每毫升原菌液活菌數＝同一稀釋度三個(gè)以上重復平皿

菌落平均數×稀釋倍數× 5

    此法還可以將稀釋的菌液取 0.2m 1 加到已制備好的平板上，然后用無(wú)菌涂棒將菌液涂布整個(gè)平板表面，放入適宜溫度下培養，計算菌落數，再按上公式計算出每毫升原菌液的所含活菌總數。

    此法可因操作不熟練造成污染，或因培養基溫度過(guò)高損傷細胞等原因造成結果不穩定。盡管如此，由于該方法能測出樣品中微量的菌數，仍是教學(xué)、科研和生產(chǎn)上常用的一種測定細菌數的有效方法。土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細菌、酵母、芽抱與抱子等的數量均可用此法測定。但不適于測定樣品中絲狀體微生物，例如放線(xiàn)菌或絲狀真菌或絲狀藍細菌等的營(yíng)養體等。

    除上述兩種常用的計數方法外，還有膜過(guò)濾法、比濁法。膜過(guò)濾法是當樣品中菌數很低時(shí)，可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品通過(guò)膜過(guò)濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計算膜上 ( 或一定面積中 ) 的細菌數；比濁法原理是在一定范圍內，菌的懸液中細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可以借助于分光光度計，在一定波長(cháng)下，測定菌懸液的光密度，以光密度 (O ． D ． ) 表示菌量。實(shí)驗測量時(shí)一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線(xiàn)性范圍內，否則不準確。微生物計數法，發(fā)展迅速，現有多種多樣的快速、簡(jiǎn)易、自動(dòng)化的儀器和裝置等方法。

2 ．重量法

    此法的原理是根據每個(gè)細胞有一定的重量而設計的。它可以用于單細胞、多細胞以及絲狀體微生物生長(cháng)的測定。將一定體積的樣品通過(guò)離心或過(guò)濾將菌體分離出來(lái)，經(jīng)洗滌，再離心后直接稱(chēng)重，求出濕重，如果是絲狀體微生物，過(guò)濾后用濾紙吸去菌絲之間的自由水，再稱(chēng)重求出濕重。不論是細菌樣品還是絲狀菌樣品，可以將它們放在已知重量的平皿或燒杯內，于 105 ℃ 烘干至恒重，取出放入干燥器內冷卻，再稱(chēng)量，求出微生物干重。

    如果要測定固體培養基上生長(cháng)的放線(xiàn)菌或絲狀真菌，可先加熱至 50 ℃ ，使瓊脂熔化，過(guò)濾得菌絲體，再用 50 ℃ 的生理鹽水洗滌菌絲，然后按上述方法求出菌絲體的濕重或干重。

    除了干重、濕重反映細胞物質(zhì)重量外，還可以通過(guò)測定細胞中蛋白質(zhì)或 DNA 的含量反映細胞物質(zhì)的量。蛋白質(zhì)是細胞的主要成分，含量也比較穩定，其中氮是蛋白質(zhì)的重要組成元素。從一定體積的樣品中分離出細胞，洗滌后，按凱氏定氮法測出總氮量。蛋白質(zhì)含氮量為 16 ％，細菌中蛋白質(zhì)含量占細菌固形物的 50 ％一 80 ％，一般以 65 ％為代表，有些細菌則只占 13 ％一 14 ％，這種變化是由菌齡和培養條件不同所產(chǎn)生的。因此總含氮量與蛋白質(zhì)總量之間的關(guān)系可按下列公式計算：

蛋白質(zhì)總量＝含氮量× 6.25

    核酸 DNA 是微生物的重要遺傳物質(zhì)，每個(gè)細菌的 DNA 含量相當恒定，平均為 8.4 × 10 -5 ng 。因此從一定體積的細菌懸液中所含的細菌中提取 DNA ，求得 DNA 含量，再計算出這一定體積的細菌懸液所含的細菌總數。

3 ．生理指標法