培養基

   培養基是人工配制的，適合微生物生長(cháng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的營(yíng)養基質(zhì)。無(wú)論是以微生物為材料的研究，還是利用微生物生產(chǎn)生物制品，都必須進(jìn)行培養基配制，它是微生物學(xué)研究和微生物發(fā)酵生產(chǎn)的基礎。

 

一、配制培養基的原則

1 ．目的明確 根據不同的微生物的營(yíng)養要求配制針對強的培養基。自養型微生物能從簡(jiǎn)單的無(wú)機物合成自身需要的糖類(lèi)、脂類(lèi)、蛋白質(zhì)、核酸、維生素等復雜的有機物，因此培養自養型微生物的培養基完全可以由簡(jiǎn)單的無(wú)機物組成。例如培養化能自養型的氧化硫桿菌的培養基組成為：

S 10g MgSO₄.7H₂O 0.5g NH₄)₂SO₄ 0.4g FeSO4 0.01g

KH₂PO₄ 4g CaCl₂ 0.25g H₂O 1000ml

    由于異養微生物合成能力較弱，不能以 CO₂ 作米唯一碳源，因此培養它們的培養基至少需要含有一種有機物質(zhì)，例如培養大腸桿菌的一種培養基是由下列化學(xué)成分組成：

葡萄糖 5g NH₄ H₂PO₄ 1g NaCl 5g MgSO₄.7H₂O 0.2g

K₂HPO₄ 1g H₂O 1000ml

    有的異養型微生物生長(cháng)還需要一種以上的有機物那么在培養基中就應該含用這些有機物質(zhì)，以滿(mǎn)足它的正常生長(cháng)。另外就微生物的主要類(lèi)群來(lái)說(shuō)，又有細菌、放線(xiàn)菌、酵母菌和霉菌之分，它們所需要的培養成分也不同，現將培養它們的培養基成分分別介紹如下：

細菌（牛肉膏蛋白胨培養基）：

牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g H₂O 1000ml

放線(xiàn)菌（高氏 1 號）

K₂HPO₄ 0.5g NaCl 0.5g MgSO₄.7H₂O 0.5g KNO₃ 1g

FeSO₄ 0.01g H₂O 1000ml

酵母菌 ( 麥芽汁培養基 )

干麥芽粉加四倍水，在 50℃ --60℃保溫糖化 3-4 小時(shí)，用碘液試驗檢查至糖化完全為止，調整糖液濃度為 10 。 巴林，煮沸后，沙布過(guò)濾，調 PH 為 6.0 。

霉菌（查氏合成培養基）

NaNO₃ 3g K₂HPO₄ 1g KCl 0.5g MgSO₄.7H₂O 0.5g

FeSO₄ 0.01g 蔗糖 30g H₂O 1000ml

    如果要分離或培養某種特殊類(lèi)型的微生物，還需要采用特殊的培養基，對于某些需要另外添加生長(cháng)因子才能生長(cháng)的微生物，還需要在培養基內添加它們所需要的生長(cháng)因子。

2 ．營(yíng)養協(xié)調

    注意各種營(yíng)養物質(zhì)的濃度與配比。培養基中營(yíng)養物質(zhì)濃度合適時(shí)微生物才能生長(cháng)良好，營(yíng)養物質(zhì)濃度過(guò)低時(shí)不能滿(mǎn)足微生物正常生長(cháng)所需，濃度過(guò)高時(shí)則可能對微生物生長(cháng)起抑制作用，例如：高濃度糖物質(zhì)、無(wú)機鹽、重金屬離子等不僅不能維持和促進(jìn)微生物的生長(cháng)，反而起到抑制或殺菌作用。另外培養基中各營(yíng)養物質(zhì)之間的濃度配比也直接影響微生物的生長(cháng)繁殖和代謝產(chǎn)物的形成和積累，其中碳氮比（ C/N ）的影響較大。碳氮比指培養基中碳元素與氮元素的物質(zhì)的量比值，有時(shí)也指培養基中還原糖與粗蛋白之比。例如，在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的過(guò)程中，培養基碳氮比為 4/1 時(shí)，菌體量繁殖，谷氨酸積累少；當培養基碳氮比為 3/1 時(shí)，菌體繁殖受到抑制，谷氨酸產(chǎn)量則大量增加。再如，在抗生素發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，可以通過(guò)控制培養基中速效氮（或碳）源與遲效氮（或碳）源之間的比例來(lái)控制菌體生長(cháng)與抗生素的合成協(xié)調。

3 ．控制 PH 、滲透壓等條件

    培養基的 PH 必須控制在一定的范圍內，以滿(mǎn)足不同類(lèi)型微生物的生長(cháng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。各類(lèi)微生物生長(cháng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的最適 PH 條件各不相同，一般來(lái)講，細胞生長(cháng)的最適 PH 范圍在 PH7.0--8.0 之間，放線(xiàn)菌在 7.5--8.5  之間，酵母菌在 3.8--6.0  之間，而霉菌則在 4.0--5.8 之間。具體的第種微生物還有其特定的最適生長(cháng) PH 范圍，但是對于某引起胡極端環(huán)境中的微生物來(lái)六，往往可以大大突破所屬類(lèi)群微生物 PH 范圍的上限和下限。在微生物生長(cháng)繁殖和代謝過(guò)程中，由于營(yíng)養物質(zhì)被分解利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累，會(huì )導致培養基 PH 發(fā)生變化，若不對培養基 PH 條件進(jìn)行控制，往往導致微生物生長(cháng)速度下降或代謝產(chǎn)物產(chǎn)量下降。因此為了維持培養基 PH 的相對恒定，通常在培養基中加入 PH 緩沖劑，常用的緩沖劑是 K₂HPO₄ KH₂PO₄ 組成的混合物。但 K₂HPO₄ / KH₂PO₄ 緩沖系統只能在一定的 PH 范圍（ PH6.4-7.2 ）內起調節作用。有些微生物，如乳酸菌能大量產(chǎn)酸，此時(shí)只級在培養基加入難溶的碳酸鹽（ CaCO₃ ）來(lái)進(jìn)行調節， CaCO₃ 難溶于水，不會(huì )使培養基 PH 過(guò)度升高，但它可以不斷中和微生物產(chǎn)生的酸，同時(shí)釋放出 CO₂ ，將培養基 PH 控制在一定范圍內。

    絕大多數微生物適宜在等滲溶液中生長(cháng)，一般培養基的滲透壓都是適合的，但培養嗜鹽微生物（如嗜鹽細菌）和嗜滲壓微生物（如高滲酵母）時(shí)就要提高培養基的滲透壓。培養嗜鹽微生物常加適量 NaCl ，海洋微生物的最適生長(cháng)鹽度約   3.5% 。培養嗜滲透微生物時(shí)要加接近飽和量的蔗糖。

4 ．經(jīng)濟節約

    在配制培養基時(shí)應盡量利用廉價(jià)且易于獲得的原料為培養基成分，特別在發(fā)酵工業(yè)中，培養基用量很大，利用低成本的原料更體現出其經(jīng)濟價(jià)值。如在微生物單細胞蛋白的工業(yè)生產(chǎn)中，常常用利用糖蜜、豆制品工業(yè)廢液等作為培養基的原料，另外大量的農副產(chǎn)呂如麩皮、米糠、玉米漿、酵母浸膏、酒糟、豆餅、花生餅等都是常用的發(fā)酵工業(yè)原料。經(jīng)濟節約原則大致有：以粗代精、以野代家、以廢代好、以簡(jiǎn)代繁、以烴代糧、以纖代糖、以氮代朊和以國（產(chǎn)）代進(jìn)（口）等方面。

 

二、培養基的類(lèi)型及應用

    培養基種類(lèi)繁多，根據其成分、物理狀態(tài)和用途可將培養分成多種類(lèi)型。

1 ．按成分不同劃分

（ 1 ）天然培養基 含用化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分不恒定的天然有機物。牛肉膏蛋白胨培養基和麥芽汁培養基就屬于此類(lèi)。常用的天然有機營(yíng)養物質(zhì)包括牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、豆芽汁、玉米粉、牛奶等。天然培養基成本較低，除在實(shí)驗室經(jīng)常使用外，也適于用來(lái)進(jìn)行工業(yè)大規模的微生物發(fā)酵生產(chǎn)。

（ 2 ）合成培養基 是化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養基。高氏 1 號培養基和查氏培養基就屬于此種類(lèi)型。配制合成培養基時(shí)重復性強但與天然培養基相比其成本較高，微生物在其中生長(cháng)速度較慢，一般適用于在實(shí)驗室用來(lái)進(jìn)行有關(guān)微生物營(yíng)養需求、代謝、分類(lèi)鑒定、生物量測定、菌種選育及遺傳分析等方面的研究工作。

2 ．根據物理狀態(tài)劃分

（ 1 ）固體培養基 在液體培養基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)即為固體培養基。培養基中的瓊脂含量一般為 1.5%-2.0% 理想的凝固劑應具有下列條件：①不被所培養的微生物分解利用；②在微生物生長(cháng)的溫度范圍內保持固體狀態(tài)；③凝固劑凝固溫度不能太低，否則不利于微生物的生長(cháng)；④凝固劑對所培養的微生物無(wú)毒害作用；⑤凝固劑在滅菌過(guò)程中不會(huì )被破壞；⑥透明度好，粘著(zhù)力強。常用的凝固劑有瓊脂（ agar ）、明膠和硅膠等。 對絕大多數微生物而言，瓊脂是最理想的凝固劑，瓊脂是藻類(lèi)（石花菜）中提取的一種高度分支的復雜多糖。

    除在液體培養基中加入凝固劑制備的固體培養外，一些由天然固體基質(zhì)制成的培養基也屬于固體培養基。如馬鈴薯塊、胡蘿卜條、米糠等制成的固體狀態(tài)的培養基就屬于此類(lèi)。又如生產(chǎn)酒的酒曲，生產(chǎn)食用菌的棉子殼培養基。

    在實(shí)驗室中，固體培養基一般加入平皿或試管中，制成培養微生物的平板或斜面。固體培養基為微生物提供一個(gè)營(yíng)養表面，單個(gè)微生物細胞在這個(gè)營(yíng)養表面進(jìn)行生長(cháng)繁殖，可以形成單個(gè)菌落。固體培養基常用來(lái)進(jìn)行微生物的分離、鑒定、活菌計數及菌種保藏。

（ 2 ）半固體培養基 半固體培養基中凝固劑的含量少比固體培養基少，培養基中瓊脂含量一般為 0.2%-0.7% 。半固體培養常用來(lái)觀(guān)察微生物的運動(dòng)特征、分類(lèi)鑒定及噬菌體效價(jià)滴定等。

（ 3 ）液體培養基 液體培養基中未加任何凝固劑，在用液體培養基培養微生物時(shí)，通過(guò)振蕩或攪拌可以增加培養基的通氣量，同時(shí)使營(yíng)養物質(zhì)分布均勻。液體培養基常用于大規模工業(yè)生產(chǎn)及在實(shí)驗室進(jìn)行微生物的基礎理論和應用方面的研究。

3 ．按用途劃分

（ 1 ）基礎培養基 盡管不同微生物的營(yíng)養需求不同，但大多數微生物所需的基本營(yíng)養物質(zhì)是相同的�；�礎培養基是含有一般微生物生長(cháng)繁殖所需的基本營(yíng)養物質(zhì)的培養基。牛肉膏蛋白胨培養基是最常用的基礎培養基。

（ 2 ）加富培養基 也稱(chēng)為營(yíng)養培養基，即在基礎培養基中加入某些特殊營(yíng)養物質(zhì)制成的一類(lèi)營(yíng)養豐富的培養基。這些特殊營(yíng)養物質(zhì)包括血液、血清、酵母浸膏、動(dòng)植物組織液等。加富培養基一般用來(lái)培養營(yíng)養要求比較苛刻的異養微生物，如培養百日咳博德氏菌需要含有血液的加富培養基。加富培養基還用來(lái)富集和分離某種微生物，這是因為加富培養基含有某種微生物所需的特殊營(yíng)養物質(zhì)，該種微生物在這種培養基中較其他微生物生長(cháng)速度快，并逐漸富集而占優(yōu)勢，逐步淘汰其他微生物，從而容易達到分離該種微生物的目的。

（ 3 ）鑒別培養基 用于鑒別不同類(lèi)型微生物的培養基。在培養基加入某種特殊化學(xué)物質(zhì)，某種微生物在培養基中生長(cháng)后能產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，而這咱代謝產(chǎn)物可以與培養基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應，產(chǎn)生明顯的特征變化，根據這種特征性變化，可將該種微生物與其他微生物區別開(kāi)來(lái)。鑒別培養基主要用于微生物的快速分類(lèi)鑒定，以及分離和篩選產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物的微生物菌種。

培養基名稱(chēng)	加入化學(xué)物質(zhì)	代謝產(chǎn)物	培養基特征性變化	主要用途
酪素培養基	酪素	胞外蛋白酶	蛋白水解圈	鑒別蛋白酶菌株
H2S 試驗培養基	醋酸鉛	H2S	產(chǎn)生黑色沉淀	鑒別產(chǎn) H 2 S 的菌株
伊紅美藍培養基	伊紅、美藍	酸	帶金屬光澤紫色菌落	鑒別大腸桿菌

（ 4 ）選擇培養基 用來(lái)將某種或某類(lèi)微生物從混雜的微生物群體中分離出來(lái)的培養基。根據不同種類(lèi)微生物的特殊營(yíng)養需求或對某種化學(xué)物質(zhì)的敏感不同，在培養基中加入相應的特殊營(yíng)養物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的微生物的生長(cháng)，有利于所需微生物的生長(cháng)。

    一種類(lèi)型選擇培養基是依據某些微生物的特殊營(yíng)養需求設計的，例如，利用以纖維素或石蠟作為唯一碳源的選擇培養基，可以從混雜的微生物群體中分離出分解纖維素或石蠟油的微生物；缺乏氮源的選擇培養基可用來(lái)分離固氮微生物。另一類(lèi)選擇培養基是在培養基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，這種化學(xué)物質(zhì)沒(méi)有營(yíng)養作用，對所需分離的微生物無(wú)害，但可以抑制或殺死其他微生物，例如分離真菌的馬丁氏選擇培養基：

葡萄糖 10 g 蛋白胨 5 g K₂HPO₄ 1g MgSO₄ .7H₂O 0.5g 瓊脂 20g H₂O 1000ml 另外加有抑制細菌生長(cháng)的孟加拉紅（ 1/3 萬(wàn)），鏈霉素（ 30 單位 / 每毫升）和金霉素（ 2 單位 / 毫升）

    現代基因克隆技術(shù)中也常用選擇培養，在篩選含重組質(zhì)粒的基因工程株過(guò)程中，利用質(zhì)粒上具有的對某種抗生素的抗性選擇標記，在培養基中加入相應抗生素，就能比較方便地淘汰非重組菌株，以減少篩選目標菌株的工作量。

    在實(shí)際應用中，有時(shí)需要配制既有選擇作用又有鑒別作用的培養基。如當要分離金黃色葡萄球菌時(shí)，在培養基中加入 7.5% NaCl 、甘露糖醇和酸堿批示劑，金黃色葡萄球菌可耐高濃度 NaCl ，且能利用甘露糖醇產(chǎn)酸。因此能在上述培養基生長(cháng)，而且菌落周?chē)�顏色發(fā)生變化，則該菌落有可能是金黃色葡萄球菌，再通過(guò)進(jìn)一步鑒定加以確定。

    盡管如此，有些病毒和立克次氏體及某些螺旋體等專(zhuān)性活細胞寄生的微生物目前還不能利用人工培養基來(lái)培養，需要接種在動(dòng)植物體內、動(dòng)植物組織中才能增殖。常用的培養病毒與立克次氏體的動(dòng)物有小白鼠、家鼠、豚鼠和雞胚。