微生態(tài)活菌總論（上）

微生態(tài)活菌總論

微生態(tài)活菌制品系由人體正常菌群成員或具有促進(jìn)正常菌群生長(cháng)和活性作用的無(wú)害外籍細菌，經(jīng)培養、收集菌體、干燥成菌粉后，加入適宜輔料混合制成。用于預防和治療因菌群失調引起的相關(guān)癥狀和疾病。

微生態(tài)活菌制品必須由非致病的活菌組成，無(wú)論在生產(chǎn)過(guò)程、制品貯存和使用期間均應保持穩定的活菌狀態(tài)。它可由一株、多株或幾種細菌制成單價(jià)或多價(jià)聯(lián)合制劑。根據其不同的使用途徑和方法可制備成片劑、膠囊劑、顆粒劑或散劑等多種劑型。

基本要求

微生態(tài)活菌制品的制備方法、工藝應能保證成品含有足夠的活菌數量，保持其穩定性，同時(shí)應防止外源因子的污染。

生產(chǎn)和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動(dòng)物等應符合“凡例”的有關(guān)要求。

制造

生產(chǎn)用菌種

生產(chǎn)用菌種應符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規定”的有關(guān)規定。

1.       名稱(chēng)及來(lái)源

選用的生產(chǎn)用菌種應來(lái)自人體內正常菌群，或對人體無(wú)毒無(wú)害、具有促進(jìn)正常菌群生長(cháng)和活性作用的外籍細菌。細菌的分離過(guò)程和傳代背景應清晰，應具備穩定的生物學(xué)和遺傳學(xué)特性，并能保持穩定的活菌狀態(tài)，經(jīng)實(shí)驗室和臨床試驗證明安全、有效。

2.       種子批的建立

菌種的屬、種型分類(lèi)鑒定，應依據最新版伯杰氏細菌系統鑒定手冊（Bergry’s Manual of Systematic Bacteriology）和伯杰氏細菌命名手冊（Bergry’s Manual of Determinative Bacteriology）的有關(guān)規定進(jìn)行，包括形態(tài)、生長(cháng)代謝特性檢查。原始種子或主種子還應做遺傳特性和抗生素敏感性等檢查。

三級種子批常規檢查包括以下3項：

（1）培養特性及染色鏡檢    將菌種接種于適宜培養基，置有氧或厭氧環(huán)境中培養，觀(guān)察其生長(cháng)情況，確定菌種為需氧性細菌或厭氧性細菌；以劃線(xiàn)法觀(guān)察在瓊脂平皿上生長(cháng)的單個(gè)菌落的形狀、大小、表面、邊緣、透明度、色澤等特征；也可觀(guān)察菌種在不同溫度、pH或不同濃度的氯化鈉溶液等條件下的生長(cháng)特性等。

取菌種的新鮮培養物涂片做革蘭氏染色，在顯微鏡下觀(guān)察菌體的染色反應、形態(tài)、大小和排列等，有芽孢的細菌應同時(shí)觀(guān)察芽孢的形狀、大小和位置（也可增做芽孢染色）。檢查結果均應符合原始菌種的特性。

（2）生化反應    按附錄ⅪⅤ“細菌生化反應培養基”選擇相應的培養基或其他適宜的方法進(jìn)行，結果應符合原始菌種的特性。

（3）毒性試驗    毒性試驗是通過(guò)動(dòng)物試驗檢查菌種是否存在不安全因素，以保證人體使用安全。

用體重18～22g小鼠5只，每只腹腔注射0.3ml新鮮菌液（不少于1.0×10⁹CFU/0.3ml）,連續觀(guān)察3天，小鼠均應健康存活、體重增加；或每只小鼠經(jīng)口灌胃0.5ml新鮮菌液（不少于1.0×10⁹CFU/0.5ml），每天1次，連續3天，從第1天灌胃起連續觀(guān)察至第7天，小鼠均應健康存活、體重增加。

除另有規定外，原始種子或主種子批還需進(jìn)行以下檢查：

（1）細菌代謝產(chǎn)物——脂肪酸測定    照氣相色譜法（附錄Ⅲ Ｃ）或其他適宜的方法進(jìn)行，應符合該菌種的特性。

（2）遺傳特性分析    可采用細菌DNA的G+Cmol%的含量測定或其他適宜方法進(jìn)行，應符合該菌種的遺傳特性。

（3）抗生素敏感性試驗   采用瓊脂擴散紙片法或其他適宜方法進(jìn)行菌株的抗生素敏感性檢查，應符合該菌種的特性。

（4）穩定性試驗    菌種在適宜培養基中，連續傳代30代次后，將第30代培養物作種子批檢定，全部檢查結果應與原始菌種的特性一致。

4.種子批的保存

原始種子和主種子應凍干保存于8℃以下，工作種子應置于適宜溫度保存。

菌粉制造

應包括種子液制備、大罐培養、收獲菌體（或芽孢）和菌體干燥制成菌粉。如生產(chǎn)多價(jià)制品時(shí)，應每種菌分別培養，制備單價(jià)菌粉。

1.       生產(chǎn)用種子

啟開(kāi)工作種子批菌種，接種于適宜培養基進(jìn)行多級種子擴增，應涂片做革蘭氏染色，在顯微鏡下觀(guān)察5～10個(gè)視野，細菌的染色反應、形態(tài)應一致并符合原始菌種的特征。制備過(guò)程應防止污染，菌種傳代次數應符合規定。

2.    生產(chǎn)用培養基

采用經(jīng)批準的培養基用于生產(chǎn)。

3.       培養

采用液體培養。將種子液置適宜條件下培養（包括厭氧或需氧、溫度、時(shí)間等），培養過(guò)程中取樣涂片做革蘭氏染色鏡檢、pH值檢測等，芽孢菌需進(jìn)行芽孢形成率的檢測，均應符合規定。培養結束后取樣做純菌檢查，如發(fā)現污染應予廢棄。

生產(chǎn)多價(jià)制品的單價(jià)菌粉時(shí)，應分別培養。

4.       收獲菌體和制成菌粉

培養結束后離心收獲濕菌體，與適宜的分散劑、穩定劑混合。采用真空冷凍干燥法干燥菌體，芽孢菌可采用加熱干燥方法，再經(jīng)粉碎、過(guò)篩制成粉末狀菌粉。

5.       菌粉的保存及有效期

應通過(guò)活菌穩定性試驗確定保存溫度和有效期。

6.       菌粉檢定

按“菌粉檢定”項進(jìn)行，符合規定后方可進(jìn)行半成品配制。

半成品

1.       配制

同一工作種子批菌種生產(chǎn)的最多2批單價(jià)菌粉可按批準的比例與輔料混合均勻后制成半成品。配制多價(jià)制品時(shí)，應將各單價(jià)菌粉、輔料按配方比例和配制程序混合均勻，配制過(guò)程應防止污染。

2.       半成品檢定

按“半成品檢定”項進(jìn)行，應符合規定。

成品

1.       劑型制備

根據制品的用途、使用對象和用藥途徑等因素確定劑型。制備過(guò)程應符合附錄Ⅰ“制劑通則”項下相關(guān)劑型的規定。

2.    分批

成品批號應在半成品配制后確定，配制日期即為生產(chǎn)日期。同一批號的制品，應來(lái)源一致、質(zhì)量均一，按規定要求抽樣檢驗后，能對整批制品作出評定。應根據驗證結果，規定半成品的分裝時(shí)間，如超過(guò)24小時(shí)，應分為不同的亞批。

3.       分裝、規格和包裝

制品的分裝應符合附錄Ⅰ“制劑通則”的有關(guān)規定。包裝應符合“生物制品包裝規程”的有關(guān)規定。規格應符合批準的規格要求。

檢定

微生態(tài)活菌制品質(zhì)量檢定應包括菌粉檢定、半成品檢定和成品檢定。

菌粉檢定

1.外觀(guān)

應為白色、灰白色或灰黃色粉末。

2.目的菌檢查

取少量菌粉加入適量，滅菌生理氯化鈉溶液或其他適宜稀釋液后，涂布在適宜瓊脂平皿上，在適宜條件下培養，其培養物的生長(cháng)特性和染色鏡檢的特征應符合生產(chǎn)用菌種特征。

3.雜菌檢查

方法和結果判斷見(jiàn)本總論附錄3。如不符合規定應廢棄。

4.干燥失重

菌粉中殘余水分的含量會(huì )直接影響活菌的生存，須進(jìn)行菌粉干燥失重的檢查。應按附錄Ⅶ Ｌ或儀器方法測定。

5.活菌數測定

測定每克菌粉中含有的活菌數量。方法見(jiàn)本總論附錄2。

半成品檢定

半成品須做雜菌檢查，根據用藥途徑確定雜菌檢查的質(zhì)控指標。方法和結果判斷見(jiàn)本總論附錄3。

成品檢定

1.       鑒別試驗

檢查成品中所含的目的菌是否符合生產(chǎn)用菌種的特性。即按上述“種子批的檢定”方法進(jìn)行生長(cháng)特性、染色鏡檢和生化反應檢查，應符合規定。對于多價(jià)制品，則須逐一檢查單價(jià)菌特性。

2.        理化檢查

（1）       外觀(guān)  根據劑型，觀(guān)察制品的外觀(guān)、色澤。

片劑外觀(guān)應完整、光潔，呈白色或類(lèi)白色，間有菌粉色斑；顆粒劑、散劑和膠囊劑內粉末的粒子大小、色澤應均勻，間有菌粉色斑。

（2）干燥失重  按附錄Ⅶ Ｌ或儀器方法測定，減失重量應不得超過(guò)5.0%，芽孢菌制品應不得超過(guò)7.0%。

（3）粒度  散劑和顆粒劑應進(jìn)行粒度檢查。

     按附錄ⅤＧ第二法，采用單篩分法或雙篩分法檢查，應符合規定。

（4）裝量（重量）差異  各劑型按附錄Ⅰ“制劑通則”的相應規定進(jìn)行，應符合規定。

（5）崩解時(shí)限  膠囊劑、片劑按附錄ⅤＣ進(jìn)行，應符合規定。

3.活菌數測定

按本總論附錄2方法測定每克制品中的活菌數，應符合規定。多價(jià)制品應分別測定各單價(jià)活菌數。

4.雜菌檢查

目的是檢查成品中外源微生物的污染情況，以保證人體使用安全。

方法和結果判斷與半成品的“雜菌檢查”項相同。

5.安全試驗

安全試驗是通過(guò)動(dòng)物試驗進(jìn)行的非特異性毒性檢查，應根據制品的使用途徑和人用劑量確定試驗方法。

（1）腸道微生態(tài)活菌制品檢查  稱(chēng)取2g制品，加入8ml生理氯化鈉溶液中，混合均勻。用5只體重18～22g小鼠，每只小鼠經(jīng)口灌胃0.5ml，每天1次，連續3天。自第1天灌胃起，連續觀(guān)察7天，小鼠應健康存活、體重增加，判為合格。如不合格，可另選10只小鼠復試1次，判定標準同前。

（2）陰道微生態(tài)活菌制品檢查  用24～26g雌性小鼠5只，，每只小鼠陰道內置入10mg制品，每天1次，連續3天。自給藥第一天起，連續觀(guān)察7天，小鼠應健康存活、體重增加，陰道局部無(wú)紅腫、分泌物等癥狀，判為合格。

保存、運輸及有效期