菌種與種子擴大培養——種子擴大培養（2）

三、影響種子質(zhì)量的主要因素

菌種擴大培養的關(guān)鍵就是搞好種子罐的擴大培養，影響種子罐培養的主要因素包括營(yíng)養條件、培養條件、染菌的控制、種子罐的級數和接種量控制等。種子罐培養除了根據菌種特性或生產(chǎn)條件恰當選擇外，還應為菌種的生長(cháng)創(chuàng )造一個(gè)最合理的培養條件。

1 ．培養基

培養基是微生物獲得生存的營(yíng)養來(lái)源，對微生物生長(cháng)繁殖、酶的活性與產(chǎn)量都有直接的影響。不同微生物對營(yíng)養要求不一樣，但它們所需的基本營(yíng)養大體上是一致的，其中以碳源、氮源、無(wú)機鹽、生長(cháng)素和金屬離子等最重要。不同類(lèi)型的微生物所需要的培養基成分與濃度配比并不完全相同，必須按照實(shí)際情況加以選擇。提高產(chǎn)量是選擇培養基的一個(gè)重要標準，但同時(shí)還應當要求培養基組成簡(jiǎn)單、來(lái)源豐富、價(jià)格便宜、取材方便等。一般來(lái)說(shuō)，種子罐是培養菌體的，培養基的糖分要少而對微生物生長(cháng)起主導作用的氮源要多，且其中無(wú)機氮源所占的比例要大些。但是，種子罐和發(fā)酵罐的培養基成分相同，使處于對數生長(cháng)期的菌種移植在適宜的環(huán)境中發(fā)酵，可以大大縮短其生長(cháng)延滯期。其原因是執行代謝活動(dòng)的酶系已經(jīng)形成，可立即實(shí)施代謝功能，不需花費時(shí)間另建適宜新環(huán)境的酶系。因此，種子罐和發(fā)酵罐的培養基成分趨于一致較好，但各成分的數量（即原料配比）需根據不同的培養目的各自確定。任何生產(chǎn)所用培養基都沒(méi)有一個(gè)可完全確定的配比，對于某一菌種和具體設備條件來(lái)說(shuō)，最適宜的配比應進(jìn)行多因素的優(yōu)選，通過(guò)對比試驗來(lái)確定。如果菌種的特性或設備條件（如罐型、攪拌的形式和轉速等）變化較大，則培養基的配比應通過(guò)試驗相對地變更。只有培養基各成分的關(guān)系選得比較恰當，才能最大限度地發(fā)揮菌種的特性，提高產(chǎn)量。

2 ．種齡與接種量

種子培養期應選取菌種的對數生長(cháng)期為宜。種齡過(guò)嫩或過(guò)老，不但延長(cháng)發(fā)酵周期，而且會(huì )降低產(chǎn)量。因此，種子的種齡必須嚴格掌握，以免貽誤時(shí)機。接種量的大小直接影響發(fā)酵周期。大量地接入成熟的菌種，可以縮短生長(cháng)過(guò)程的緩慢期，因而縮短了發(fā)酵周期，節約了發(fā)酵培養的動(dòng)力消耗，提高了設備利用率，并有利于減少染菌機會(huì )。所以，一般都將菌種擴大培養，進(jìn)行兩級發(fā)酵或三級發(fā)酵。接種量影響緩慢期的原因，是由于在大量移種過(guò)程中把微生物生長(cháng)和分裂所必需的代謝物（一般是R NA ，即核糖核酸）一起帶進(jìn)去，從而有利于微生物立即進(jìn)入對數生長(cháng)階段。但是，如果培養基內的營(yíng)養物和氣體張力對菌體生長(cháng)適宜，則接種量的影響較小。一般來(lái)說(shuō)，接種量和培養物的生長(cháng)過(guò)程的緩慢期長(cháng)短呈反比。接種量過(guò)多也沒(méi)有必要，因種子培養費時(shí)，且過(guò)多地移入代謝廢物，反而會(huì )影響正常發(fā)酵。

3 ．溫度

溫度對微生物的影響，不僅表現在對菌體表面的作用，而且因熱平衡的關(guān)系，熱傳遞至菌體內，對菌體內部所有的物質(zhì)都有作用。由于生物體的生命活動(dòng)可以看作是相互連續進(jìn)行的酶反應的表現，任何化學(xué)反應又都和溫度有關(guān)，通常在生物學(xué)范圍內每升高10 ℃ ，生長(cháng)速度就加快1 倍，所以，溫度直接影響酶反應，進(jìn)而影響著(zhù)生物體的生命活動(dòng)。對于微生物來(lái)說(shuō)，溫度直接影響其生長(cháng)和合成酶活動(dòng)。

任何微生物的生長(cháng)都需要有適宜的生長(cháng)溫度，在此溫度范圍內，微生物生長(cháng)、繁殖最決。大多數微生物的最適生長(cháng)溫度在25-37 ℃ 范圍內，細菌的最適生長(cháng)溫度大多比霉菌高些。如果所培養的微生物能承受稍高一些的溫度進(jìn)行生長(cháng)、繁殖，可減少污染雜菌的機會(huì )，減少夏季培養所需降溫的輔助設備，對工業(yè)生產(chǎn)有很大的好處。

溫度和微生物生長(cháng)的關(guān)系，一方面在其最適溫度范圍內，生長(cháng)速度隨溫度升高而增加；另一方面，不同生長(cháng)階段的微生物對溫度的反應不同。處于緩慢期的細菌對于溫度的影響十分敏感，將其置于最適生長(cháng)溫度附近，可以縮短其生長(cháng)的緩慢期；將其置于較低的溫度，則會(huì )延長(cháng)其緩慢期；而且孢子萌發(fā)的時(shí)間在一定溫度范圍內也隨溫度的上升而縮短。處于對數生長(cháng)期的細菌，如果在略低于最適溫度的條件下培養，即使在發(fā)酵過(guò)程中升溫，其升溫的破壞作用也顯得較弱。因而在最適生長(cháng)溫度范圍內，組成菌體的蛋白質(zhì)很少變性，所以在最適溫度范圍內適當提高對數生長(cháng)期的培養溫度，既有利于菌體的生長(cháng)，又能避免熱作用的破壞。處于生長(cháng)后期的細菌，一般來(lái)說(shuō)其生長(cháng)速度主要取決于溶解氧而不是溫度，因此在培養后期可適當提高通氣量。此外，不管微生物處于哪種生長(cháng)階段，每種微生物都有自己的最高生長(cháng)溫度和最低生長(cháng)溫度。為了使種子罐培養溫度控制在一定的范圍，生產(chǎn)上常在種子罐上安裝熱交換設備，如夾套、排管或蛇管等進(jìn)行溫度調節，冬季進(jìn)風(fēng)時(shí)還要加熱。

4．pH 值

培養基的氫離子濃度對微生物的生命活動(dòng)有顯著(zhù)影響。各種微生物都有自己生長(cháng)與合成酶的最適pH 值。同一菌種合成酶的類(lèi)型與酶系組成可隨pH 值的改變而產(chǎn)生不同程度的變化。例如，黑曲霉合成柚苷酶時(shí)，培養基在pH 6.0以上的環(huán)境中，果膠酶活性受到抑制，pH 值改變到6.0以下就形成果膠酶，且酶系組成由pH 值決定。泡盛酒曲霉突變株在pH 6.0培養時(shí)以產(chǎn)生α-淀粉酶為主，糖化型淀粉酶與麥芽糖酶產(chǎn)生極少，在pH 2.4 條件下培養，轉向糖化型淀粉酶與麥芽糖酶的合成，α-淀粉酶受到抑制。

由此可見(jiàn)，培養基的pH 值與微生物生命活動(dòng)和酶系組成關(guān)系十分密切。培養基pH 值在發(fā)酵過(guò)程中能被菌體代謝所改變，陰離子（如醋酸根、磷酸根）被吸收或氮源被利用后NH₃ 的產(chǎn)生，使pH 值上升；陽(yáng)離子（如NH₄⁺，K ⁺ ）被吸收或有機酸的積累，使pH 值下降。一般來(lái)說(shuō)，高碳源培養基傾向于向酸性pH 值轉移，高氮源培養基傾向于向堿性pH 值轉移，這都跟碳氮比直接有關(guān)。因此，培養基必須保持適當的pH 值，而調節pH 值的方法有三種，即使用酸堿溶液、緩沖液以及各種生理緩沖劑（如生理酸性與生理堿性的鹽類(lèi)）。

5 ．通氣和攪拌

需氧菌或兼性需氧菌的生長(cháng)與合成酶，都需要供給氧氣。不同微生物要求的通氣量不同，即使是同一菌種，在不同生理時(shí)期對通氣量的要求也不相同。因此，在控制通氣條件時(shí)，必須考慮到既能滿(mǎn)足菌種生長(cháng)與合成酶的不同要求，又要節省電耗，以提高經(jīng)濟效益。通氣可以供給大量的氧，而攪拌則能使通氣的效果更好，并且攪拌有利于熱交換，使培養液的溫度較一致，有利于營(yíng)養物質(zhì)和代謝物的分散。此外，選用擋板可使攪拌效果更好。通氣量與菌種、培養基的性質(zhì)以及培養階段有關(guān)。在培養階段的各個(gè)時(shí)期究竟如何選擇通氣量，要根據菌種的特性、罐的結構、培養基的性質(zhì)等許多因素，通過(guò)試驗確定。通氣量的多少，最好按氧溶解的多少決定。只有氧溶解的速度大于菌體的吸氧量時(shí)，菌體才能正常地生長(cháng)和合成酶，否則氧的溶解比消耗少，氧的濃度降低，降到某一濃度（稱(chēng)溶解氧的臨界點(diǎn)）時(shí)，菌體生長(cháng)就減慢。因此，隨著(zhù)菌體的繁殖，呼吸增強，必須按菌體的吸氧量加大通氣量，以增加溶解氧的量。一般來(lái)說(shuō)，培養罐深、攪拌轉速大、通氣管開(kāi)孔小或多，氣泡在培養液內停留時(shí)間就長(cháng)，氧的溶解速度也就大，且在這些因素確定的條件下，培養基的粘度越小，氧的溶解速度也越大。因此，根據罐的結構考慮培養液的粘度，增加一定通氣量，可以達到菌體所需的溶解氧，滿(mǎn)足菌體呼吸的需要。

攪拌可以提高通氣效果，促進(jìn)微生物的繁殖，但是劇烈攪拌會(huì )導致培養液大量涌泡，液膜表層的酶容易氧化變性，損傷微生物細胞，同時(shí)，泡沫過(guò)多將增加污染雜菌的機會(huì )。6 ．泡沫

菌種培養過(guò)程中產(chǎn)生的泡沫與微生物的生長(cháng)和合成酶有關(guān)。泡沫的持久存在影響微生物對氧的吸收，妨礙二氧化碳的排除，因而破壞其生理代謝的正常進(jìn)行，不利于發(fā)酵。此外，由于泡沫大量地產(chǎn)生，致使培養液的容量一般只是種子罐容量的一半左右，大大影響設備的利用率，甚至發(fā)生跑料現象，導致染菌，使損失更大。

在菌種培養過(guò)程中產(chǎn)生泡沫的原因是很多的。通氣、機械攪拌使液體分散和空氣竄入形成氣泡，培養基中某些成分的變化或微生物的代謝活動(dòng)產(chǎn)生氣泡，培養基中某些成分（如蛋白質(zhì)及其他膠體物質(zhì)）的分子在氣泡表面排列形成堅固的薄膜，不易破裂，聚成泡沫層。關(guān)于菌種培養過(guò)程的消泡措施，主要偏重于化學(xué)消泡和機械消泡，并取得一定的進(jìn)展。微生物工業(yè)目前使用的消泡劑，有各種天然的動(dòng)植物油以及來(lái)自石油化工生產(chǎn)的礦物油、改性油、表面活性劑等，這類(lèi)消泡劑往往因培養液的pH 值、溫度、成分、離子濃度以及表面性質(zhì)的改變，在消泡能力上呈現很大的差別，在培養液內殘留量也高，給凈化處理造成不同程度的困難。而新型的有機硅聚合物如硅油、硅酮樹(shù)脂等，則具有效率高、用量省、無(wú)毒性、無(wú)代謝性，同時(shí)兼有提高微生物合成酶等多種優(yōu)良特性，是一類(lèi)有發(fā)展前途的消泡劑。泡沫的控制除了添加消泡劑外，改進(jìn)培養基成分也是相輔相成的一個(gè)重要方面。例如，在培養基配料中增加磷酸鹽已在某些場(chǎng)合收到實(shí)效，可使消泡劑添加量成倍地降低。

7 ．染菌的控制

染菌是微生物發(fā)酵生產(chǎn)的大敵，一旦發(fā)現染菌，應及時(shí)進(jìn)行處理，以免造成更大的損失。染菌的原因，如果不是設備本身結構存在“死角”，歸納起來(lái)主要包括設備、管道、閥門(mén)漏損，滅菌不徹底，空氣凈化不好，無(wú)菌操作不嚴或菌種不純等問(wèn)題。因此，要控制染菌繼續發(fā)展，必須及時(shí)找出染菌的原因，采取措施，杜絕染菌事故再現。菌種發(fā)生染菌會(huì )使各個(gè)發(fā)酵罐都染菌，因此，必須加強接種室的消毒管理工作，定期檢查消毒效果，嚴格無(wú)菌操作技術(shù)。如果新菌種不純，則需反復分離，直至完全純粹為止。對于已出現雜菌菌落或噬菌體噬斑的試管斜面菌種，應予以廢棄。在平時(shí)應經(jīng)常分離試管菌種，以防菌種衰退、變異和污染雜菌。對于菌種擴大培養的工藝條件要嚴格控制，對種子質(zhì)量更要嚴格掌握，必要時(shí)可將種子罐冷卻，取樣做純菌試驗，確認種子無(wú)雜菌存在，才能向發(fā)酵培養基中接種。

8 ．種子罐級數的確定

種子罐的級數愈少，愈有利于簡(jiǎn)化工藝，便于控制。級數少可減少種子罐污染雜菌的機會(huì )，減少消毒、值班工作量以及減少因種子罐生長(cháng)異常而造成發(fā)酵的波動(dòng)。但是，也應當考慮到如何才能最大限度地降低發(fā)酵罐中非合成代謝產(chǎn)物的生成。所以，種子罐級數的確定取決于菌種的性質(zhì)（如菌種傳代后的穩定性）、孢子瓶中的孢子數、孢子發(fā)芽、菌絲繁殖速度以及發(fā)酵罐中種子培養液的最低接種量和種子罐與發(fā)酵罐的容積比。如果孢子瓶中的孢子數量較多，孢子在種子罐中發(fā)育較快，且對發(fā)酵罐的最低接種量的要求亦較小，顯然可采用二級發(fā)酵流程。種子罐的級數由產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規模而定，也隨著(zhù)工藝條件的改變作適當的調整。例如，改變種子罐的培養條件、加速孢子的發(fā)育或改進(jìn)孢子瓶的培養工藝后可大大增加孢子數量等，在此基礎上均有可能使三級發(fā)酵簡(jiǎn)化為二級發(fā)酵。

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