菌種與種子擴大培養——微生物工業(yè)用菌種（2）

三、菌種保藏

    微生物工業(yè)生產(chǎn)與純種培養、菌種質(zhì)量密切相關(guān)，而菌種質(zhì)量又與菌種的制備和保藏直接相關(guān)，所以說(shuō)，菌種保藏是微生物工業(yè)生產(chǎn)的重要環(huán)節。菌種保藏的目的是保證菌種在長(cháng)時(shí)間內盡可能保持原有菌株優(yōu)良的生產(chǎn)性能，提高菌種的存活率，減少菌種的變異，以及不被雜菌污染以利于生產(chǎn)上長(cháng)期使用。

    菌種保藏的基本原理是根據菌種的生理、生化特點(diǎn)，創(chuàng )造條件使菌種的代謝活動(dòng)處于不活潑狀態(tài)。在長(cháng)期保藏菌種的實(shí)踐中人們采用了多種方法，以適應不同的微生物。雖然不同的菌種的保藏方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但其基本原則相同：選用優(yōu)良純種和創(chuàng )造一個(gè)最有利于菌種休眠的環(huán)境，即微生物生長(cháng)繁殖和代謝受抑且不易突變的環(huán)境。這種環(huán)境要求干燥、低溫、缺氧、缺營(yíng)養、添加保護劑等。

下面介紹微生物工業(yè)菌種常用的保藏方法。

1 ．定期移植低溫保藏法

    將菌種接到培養基斜面進(jìn)行斜面培養或穿刺培養，也可進(jìn)行液體培養，待長(cháng)成健壯的菌體（對數期細胞、有性孢子、無(wú)性孢子等）后，置于4 ℃ 冰箱保存，間隔一定時(shí)間需要重新進(jìn)行移植培養。例如，細菌通常1 個(gè)月移種一次，芽孢桿菌3 -6 個(gè)月移種一次，放線(xiàn)菌3 個(gè)月移種一次，酵母菌4-6 個(gè)月移種一次，絲狀真菌4 個(gè)月移種一次。

    定期移植保藏法在工廠(chǎng)和實(shí)驗室中普遍使用，具有簡(jiǎn)單易行、代價(jià)小，且可隨時(shí)觀(guān)察保藏菌種的死亡、變異、退化或染菌等優(yōu)點(diǎn)，但因微生物在保藏期間仍有活動(dòng)，所以存在保藏時(shí)間偏短、菌種易退化等不足。不過(guò)，酒精酵母經(jīng)過(guò)數十年的移植沒(méi)有發(fā)現變異或衰退現象。如果用滅菌的橡皮塞代替棉塞，則由于避免了水分的散失且隔絕氧氣而能適當延長(cháng)保藏期。采用石蠟液封菌體表面（液封面高出菌種表面1cm），同樣能延長(cháng)保藏期，這就是所謂的液體石蠟保藏法。

2 ．液氮超低溫保藏法

    此法被公認為最有效和適用范圍最廣的菌種長(cháng)期保藏技術(shù)之一，需要液氮罐或液氮冰箱、圓底安瓶管或塑料液氮保藏管。由于保藏采用低溫-196～-150℃ ，必須按照“先慢后快”的原則進(jìn)行操作。具體操作步驟如下：
( 1 ）將10%甘油或二甲亞砜作為保護劑分裝于安瓿瓶中；

( 2 ）將長(cháng)有菌落的瓊脂懸浮于已滅菌的保護劑中；

( 3 ）熔封安瓿瓶口；

( 4 ）以1min下降1 ℃ 的速度降至-35 ℃ ，使瓶?jì)葢腋∫后w凍結，然后將安瓶瓶置液氮冰箱中，于-130℃ 以下儲藏；

( 5 ）恢復培養時(shí)，從液氮中取出安瓿瓶，立即于38-40 ℃ 水浴中搖動(dòng)，至瓶?jì)鹊谋�全部融化，按常法進(jìn)行培養。

3 ．甘油低溫保藏法

    與液氮超低溫保藏法類(lèi)似，采用含10%-30%甘油的蒸餾水懸浮菌種，置于-80～-70 ℃ 溫度下保藏，因此需要超低溫冰箱。該法保藏期一般在1 年以上，特別適于基因工程菌株的保藏。

4．沙土保藏法

    此法適于芽孢桿菌、放線(xiàn)菌、曲霉菌等的保藏，保藏方法簡(jiǎn)單，主要過(guò)程如下：土壤（河沙需要10%-20% H Cl 溶液洗去有機質(zhì)）經(jīng)風(fēng)干、過(guò)24 目篩、分裝滅菌后，加入10 滴置備好的細胞或孢子懸液，然后在干燥器中吸干水分，再用火焰熔封管口，在室溫或低溫下可保藏數年。

5 ．麩皮保藏法

    麩皮保藏法又稱(chēng)為曲法保藏，常用于放線(xiàn)菌、霉菌等的保藏。將麩皮或其他谷物與培養基或水按一定比例（按菌種要求而定，一般質(zhì)量比為1：1 ）拌勻，分裝、滅菌后加入菌種培養，至長(cháng)出菌絲，用干燥器干燥后在溫度20 ℃ 條件下可長(cháng)期保藏而不退化，故工廠(chǎng)經(jīng)常采用。

6 ．蒸餾水保藏法

    此法是20世紀50年代開(kāi)始采用的最簡(jiǎn)單的菌種保藏法，適用于酵母、真菌等。其原理是創(chuàng )造一個(gè)無(wú)營(yíng)養的環(huán)境，在4-10 ℃ 下可較長(cháng)時(shí)間保藏菌種。

7 ．冷凍干燥保藏法

    冷凍干燥保藏法是非常有效的菌種保藏法，采用干燥、低溫、缺氧的條件保藏菌種，但需要冷凍干燥機等設備，操作復雜，菌種存活率的影響因素多，故其應用受限，主要在專(zhuān)業(yè)菌種保存單位采用。

四、菌種選育

    菌種選育就是按照生產(chǎn)的要求，以微生物遺傳變異理論為依據，采用人工方法使菌種發(fā)生變異，再用各種篩選方法篩選出符合要求的目的菌種。菌種選育的目的包括改善菌種特性，以提高產(chǎn)量、改進(jìn)質(zhì)量、降低成本、改革工藝、方便管理及綜合利用。選育菌種的基本方法包括自然選育、抗噬菌體選育、誘變育種、代謝控制育種、基因定向育種等一系列方法。

   誘變育種是采用物理、化學(xué)誘變因素使微生物DNA 上的堿基發(fā)生改變，而排列錯誤的D NA 模板形成異常的遺傳信息，造成某些蛋白結構變異，導致細胞功能的改變。

代謝調控育種主要包括改變代謝通路的育種、改變自我代謝調節系統的育種。

基因定向育種主要是通過(guò)轉化、轉導、轉染、雜交等手段有目的地增加、增強或取消、減弱某個(gè)或某些基因，從而得到需要的工程菌株。

有關(guān)育種的具體方法在微生物學(xué)中已有詳細介紹，這里不再贅述。

五、防止菌種退化的措施

菌種退化是指整個(gè)菌體在多次接種傳代過(guò)程中逐漸造成菌種發(fā)酵力（如糖、氮的消耗）或繁殖力（如孢子的產(chǎn)生）下降或發(fā)酵產(chǎn)物得率降低的現象。對此，首先要鑒定是否由于染菌引起產(chǎn)量下降或菌種生長(cháng)延緩，可直接進(jìn)行鏡檢判斷或采用劃線(xiàn)分離來(lái)確定是染菌還是菌種退化；其次要判斷是否由于培養條件引起的暫時(shí)性變化，可通過(guò)培養幾批菌種觀(guān)察生長(cháng)代謝情況來(lái)確定。

菌種退化的原因有兩方面：一是菌種保藏不妥；二是菌種生長(cháng)的要求沒(méi)有得到滿(mǎn)足，例如，遇到某些不利的條件，或失去某些需要的條件，或誘變型新菌株發(fā)生回復突變而喪失新的特性。

如果發(fā)現菌株已經(jīng)發(fā)生退化，產(chǎn)量下降，則要進(jìn)行分離復壯。因為在菌種發(fā)生衰退的時(shí)候，并不是所有的菌體都衰退，其中未衰退的菌體往往是經(jīng)過(guò)環(huán)境考驗的、具有更強生命力的菌體。因此，采用單細胞菌株分離的措施，即用稀釋平板法或平板劃線(xiàn)法，以取得單細胞長(cháng)成的菌落，再通過(guò)菌落和菌體的特征分析和性能測定，就可獲得具有原來(lái)性狀的菌株，甚至性狀更好的菌株。對于某些菌種，還可配合其他辦法分離單細胞菌株，如對芽孢桿菌，可先將菌液用沸水處理數分鐘，再用平板進(jìn)行分離，從所剩的孢子中挑選出最優(yōu)的菌體來(lái)。

如果遇到某些菌株，即使進(jìn)行單細胞分離仍不能達到復壯的效果，則可改變培養條件，以達到復壯的目的。例如，AT3.942 棲土曲霉的產(chǎn)孢子能力下降，可適當提高培養溫度，恢復其能力。同時(shí)，通過(guò)實(shí)驗選擇一種有利于高產(chǎn)菌株而不利于低產(chǎn)菌株的培養條件，能夠得到產(chǎn)量較高的菌株。如果將單菌落分離和一定的培養條件相結合進(jìn)行復壯，則更為有效。

此外，產(chǎn)生退化現象的原因多為基因突變，所以使用誘變劑處理，對退化類(lèi)型的菌株具有殺傷力，則經(jīng)誘變劑處理后再進(jìn)行單菌落分離，就可得到復壯的菌株。同樣道理，其他不具誘變作用的物理和化學(xué)因素也可用于復壯處理，但需針對具體菌種進(jìn)行具體分析，以采用最佳的復壯方法。

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