培養基的滅菌

式中：N₀—開(kāi)始滅菌（t=0）時(shí)原有活菌數；      Nt----經(jīng)時(shí)間t后殘存活菌數。

k：意義同上；t ：表示理論滅菌時(shí)間

k=（2.303/t）logN_t/N₀；比死亡速率常數K，K值大，表明微生物容易死亡。

（1）K值因不同的微生物種類(lèi)不同、不同的生理狀態(tài)、不同的外界環(huán)境，差別很大，實(shí)質(zhì)上，它是微生物熱阻的一種表示形式，微生物的熱阻越大，K值也越小。可以取耐熱性芽孢桿菌的K進(jìn)行計算。

(2)在計算過(guò)程中，N₀，N_t如何取值？

    N₀ 為滅菌開(kāi)始時(shí)培養基中活微生物數，可以參考一般培養基中的活微生物數為（1-2）×10⁷個(gè)/ml； Nt 通常取 0.001個(gè)，既滅菌失敗的概率為千分之一。

（3）上述滅菌時(shí)間，通常稱(chēng)之為理論滅菌時(shí)間，只可以用于工程計算中，在實(shí)踐過(guò)程中，因蒸汽的壓力問(wèn)題（不穩定）、蒸汽的流量問(wèn)題有很大差別，甚至培養基中的固體顆粒的大小、培養基的粘度等因素，都會(huì )影響滅菌效果，實(shí)際的設計和操作計算時(shí)間可作適當比例的延長(cháng)或縮短。在實(shí)際生產(chǎn)中，通常采用經(jīng)驗數值：間歇滅菌，121℃，20—30分鐘；連續滅菌，137℃，15—30s，在維持罐中保溫8—20分鐘。

   在培養基滅菌過(guò)程中，除了雜菌死亡，還伴隨著(zhù)培養基成分的破壞。因此必須選擇既能達到滅菌目的，又能使培養基的破壞降低至最低的工藝條件。

 許多實(shí)驗研究結果表明，培養基在高溫滅菌的過(guò)程中，其營(yíng)養成分的破壞在很大程度上可以用一級反應來(lái)描述其反應速度：

                

 式中— 表示營(yíng)養成分破環(huán)的速率，

          C：表示營(yíng)養成分的濃度

          K^'：為反應速度常數，1/s，應速度常數K^'與溫度的關(guān)系，可以使用阿累尼烏斯公式表示之：

 

    K^'=   A'exp^{- △E'/RT}……（1）

   式中—— ：反應速度常數，1/S

           ：反應的活化能（J/mol）

           R：氣體常數，1.987*4.18 J/mol*k

           T：反應的絕對溫度，k

同樣，滅菌過(guò)程中的反應速度常數也可以用下式表示出：

      K = A×exp[-E/RT]        …… （2）

（1）、（2）式可以改寫(xiě)成下列形式：

  lg(k,2/k,1) = E,/R×(1/T1 – T2 )   ……     （3）

 lg(k2/k1) = E/R×(1/T1 – T2 )    ……    （4）

 （3）（4）的意義是指：反應的溫度從T1 升高到 T2 ，其反應的速度常數分別從k,1 增加到 k,2；k1 增加到 k2；

培養基的滅菌過(guò)程實(shí)際上是營(yíng)養成分破壞、菌體死亡的兩個(gè)平行性反應，對于平行性反應，反應溫度的提高，其兩個(gè)平行性反應的速度常數都增加，但增加的幅度（大�。﹨s不同，其比值可以表示為：

     lg(k2/k1)/lg(k,2/ k,1)= E / E,   …… (5)

  實(shí)驗證明：營(yíng)養成分為破壞的反應的活化能E的值為E, = 8.36—83.6*103 J/mol；而菌體死亡的活化能E芽孢：E = 418*103 J/mol；無(wú)芽孢：E = 209—250*103 J/mol。顯然，（5）式的比值〉1，說(shuō)明提高溫度對于第二個(gè)平行反應，即菌體死亡的反應是有利的。提高溫度，雖然兩個(gè)平行性反應的反應速度常數都提高了，但是，達到同樣的滅菌效果，所需要的時(shí)間卻縮短了，由于第一個(gè)反應也就是營(yíng)養成分破壞的反應速度常速增加的少，因此，有利于減少培養基在滅菌過(guò)程中營(yíng)養成分的破壞。換言之，高溫短時(shí)滅菌對于培養基營(yíng)養成分是有利的。通常所說(shuō)的高溫短時(shí)滅菌可以提高生產(chǎn)效益，其理論根據就在于此。

 

 

 

 

 

（一）、實(shí)驗室種子培養基滅菌方法

1、高壓蒸汽滅菌鍋、 手提式滅菌鍋。容量小。

2、立式或臥式滅菌鍋。容量較大， 一般能裝幾十瓶或幾百瓶。

3、滅菌柜。要和蒸汽鍋爐配套， 用于大量種瓶培養基的滅菌， 一次能裝幾百至幾千瓶(袋)。

 

 

2、滅菌過(guò)程

過(guò)程包括升溫、保溫和冷卻等三個(gè)階段，各階段對滅菌的貢獻：20%、75%、5%。培養基的升溫可由兩種方式實(shí)現：間接加熱，在夾套或蛇管中通入蒸汽加熱；直接加熱，在培養基中直接通入熱蒸汽加熱。

   滅菌過(guò)程中加熱和保溫階段的滅菌作用是主要的，而冷卻階段的滅菌作用是次要的，一般很小，可以忽略不計。此外，還應指出的是，應當避免長(cháng)時(shí)間的加熱階段，因為加熱時(shí)間過(guò)長(cháng)，不僅破壞營(yíng)養物質(zhì)，而且也有可能引起培養液中某些有害物質(zhì)的生成，從而影響培養過(guò)程的順利進(jìn)行。

    在實(shí)際生產(chǎn)中，也可能遇到所供蒸汽不足、溫度不夠高的情況，這時(shí)可以適當延長(cháng)滅菌時(shí)間。生產(chǎn)上甚至有用100℃蒸煮而達到徹底滅菌的實(shí)例。如要做固體曲而沒(méi)有高溫蒸汽時(shí)，可將原料用100蒸汽蒸30min，殺死其中的營(yíng)養細胞，但孢子與細菌的芽孢沒(méi)有被殺死。   將蒸過(guò)的原料置于室溫下過(guò)夜，未被殺死的孢子便發(fā)芽生長(cháng)，芽孢發(fā)育成營(yíng)養細胞，再30min便可殺死。如此連續反復進(jìn)行2-3次，亦可達到徹底滅菌的目的。

 

    分批滅歇是在所用的發(fā)酵罐或其他培養裝置中進(jìn)行的，它是在配制罐中配好培養基后，通過(guò)專(zhuān)用管道輸入發(fā)酵罐等培養設備中，然后開(kāi)始滅菌。在進(jìn)行培養基的間歇滅菌之前，通常先將發(fā)酵罐等培養裝置的分空氣過(guò)濾器進(jìn)行滅菌，并且用空氣將分過(guò)濾器吹干。開(kāi)始滅菌時(shí)，應先放去夾套或蛇管中的冷水，開(kāi)啟排氣管閥，通過(guò)空氣管向發(fā)酵罐內的培養基通入蒸汽進(jìn)行加熱，同時(shí)，也可在夾套內通蒸汽進(jìn)行間接加熱。當培養基溫度升到70℃左右時(shí)，從取樣管和放料管向罐內通入蒸汽進(jìn)一步加熱，當溫度升至120℃，罐壓為1*10⁵Pa（表壓）時(shí)，打開(kāi)接種、補料、消泡劑、酸、堿等管道閥門(mén)進(jìn)行排汽，當然在保溫過(guò)程中，應注意凡在培養基液面下的各種進(jìn)口管道都應通入蒸汽，而在液面以上的其余各管道則應排放蒸汽，這樣才能不留死角，從而保證滅菌徹底。保溫結束后，依次關(guān)閉各排汽、進(jìn)汽閥門(mén)，待罐內壓力低于空氣壓力后，向罐內通入無(wú)菌空氣，在夾套或蛇管中通冷水降溫，使培養基的溫度降到所需的溫度，進(jìn)行下一步的發(fā)酵和培養。

    由于培養基的間歇滅菌不需要專(zhuān)門(mén)的滅菌設備，投資少，對設備要求簡(jiǎn)單，對蒸汽的要求也比較低，且滅菌效果可靠，因此，間歇滅菌是中小型生產(chǎn)工廠(chǎng)經(jīng)常采用的一種培養基滅菌方法。

 

1、定義：連續滅菌也叫連消，將配制好的并經(jīng)預熱（60～75℃）的培養基用泵連續輸入由直接蒸汽加熱的加熱塔，使在短時(shí)間內達到滅菌溫度（126～132℃）。然后進(jìn)入維持罐（或維持管），使在滅菌溫度下維持3～7分鐘后再進(jìn)入冷卻管，使其冷卻至接種溫度并直接進(jìn)入已事先滅菌（空罐滅菌）過(guò)的發(fā)酵罐內。其溫度一般以126～132 ℃為宜，總蒸汽壓力要求達到0.044～0.049 MPa以上。

培養基的冷卻方式有噴淋冷卻式、真空冷卻式、薄板換熱器式幾種方式，其過(guò)程均包括加熱、維持和冷卻階段。

 

2、連續滅菌的流程：

（1）由熱交換器組成的滅菌系統