工業(yè)微生物菌種的選育——誘變選育（1）

（二）、誘變育種方案設計

誘變育種方案包括突變的誘發(fā)、突變株的篩選和突變高產(chǎn)基因的表現。

 

1、出發(fā)菌株的選擇

工業(yè)上用來(lái)進(jìn)行誘變處理的菌株，稱(chēng)為出發(fā)菌株。出發(fā)菌株選擇目前主要依據實(shí)際經(jīng)驗，總結如下： ①以單倍體純種為出發(fā)菌株； ②采用具有優(yōu)良性狀的菌株；③選擇對誘變劑敏感的菌株；④許多高產(chǎn)突變往往要經(jīng)過(guò)逐步累積的過(guò)程，才變得明顯，所以有必要多挑選一些已經(jīng)過(guò)誘變的菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)行多步育種，確保高產(chǎn)菌株的獲得。

 

2、出發(fā)菌株的純化

為什么要對出發(fā)菌株進(jìn)行純化呢？這是因為微生物容易發(fā)生變異和染菌，同時(shí)一般絲狀菌的野生菌株多為異核體。生產(chǎn)菌在不斷移代過(guò)程中，菌絲間接觸、吻合后，易產(chǎn)生異核體、部分結合子、雜合二倍體及自然突變株等。這些都會(huì )造成細胞內遺傳物質(zhì)的異質(zhì)化，使遺傳性狀不穩定。通過(guò)純種分離，從中挑選所需的優(yōu)良菌株。常用劃線(xiàn)分離和稀釋分離法，并結合顯微鏡操縱器分離單孢子。

 

3、單孢子懸液的制備

誘變育種要求所處理的細胞必須是處于對數生長(cháng)期同步生長(cháng)的細胞，并且是均勻狀態(tài)的單細胞懸液。

首先是細胞的生理狀態(tài)對誘變處理也會(huì )產(chǎn)生很大的影響，如細菌在對數期誘變處理效果較好；霉菌或放線(xiàn)菌的分生孢子一般都處于休眠狀態(tài)，所以培養時(shí)間的長(cháng)短對孢子影響不大，但稍加萌發(fā)后的孢子則可提高誘變效率。

其次是分散狀態(tài)的細胞可以均勻地接觸誘變劑，又可避免長(cháng)出不純菌落。由于在許多微生物的細胞內同時(shí)含有幾個(gè)核，所以即使用單細胞懸浮液處理，還是容易出現不純的菌落。若誘變劑產(chǎn)生的突變只在 DNA雙鏈中的某一條單鏈，故該突變無(wú)法反映在當代的表型上。只經(jīng)過(guò)DNA的復制和細胞分裂，表型才會(huì )發(fā)生變異，出現不純菌落，這就叫表型延遲 (phenotypic lag) 。不純菌落的存在，也是誘變育種工作中初分離的菌株經(jīng)傳代后很快出現生產(chǎn)性狀 “衰退”的主要原因。��

（1）供試菌株的孢子或菌體的選擇

供試細胞要新培養的，細胞生理活性既要同步，又要在最旺盛的對數期，這樣突變率高，重現性也好。對細菌來(lái)說(shuō)，常常通過(guò)前培養達到要求。菌懸液中的菌體應該是單細胞或單核的孢子，不但能均勻地接觸誘變劑，還可減少分離現象發(fā)生。在實(shí)際工作中，要得到均勻分散的細胞懸液，通�？捎脽o(wú)菌的玻璃珠來(lái)打散成團的細胞，然后再用脫脂棉或濾紙過(guò)濾。��

菌懸液的細胞濃度一般控制為：真菌孢子或酵母細胞 10 ⁶ ~ 10 ⁷ 個(gè)/ml，放線(xiàn)菌或細菌10 ⁸ 個(gè)/ml。菌懸液一般用生理鹽水（0.85%NaCl）稀釋。有時(shí)，也需用0.1mol/L磷酸緩沖液稀釋?zhuān)�因為有些化學(xué)誘變劑處理時(shí)，常會(huì )改變反應液的pH值。 

（2）菌懸液制備方法

細菌：在誘變處理前進(jìn)行搖瓶振蕩培養，利用溫度和碳源控制其同步生長(cháng)，離心洗滌，用冷生理鹽水或緩沖液制備菌懸液，放在有玻璃珠的三角瓶?jì)日袷?0min，用無(wú)菌脫脂棉或濾紙過(guò)濾，通過(guò)菌體計數，調整菌懸液的濃度。孢子：在試驗中盡量采用成熟而成熟的孢子，并置于液體培養基中振蕩培養到孢子剛萌發(fā)，即芽長(cháng)相當孢子直徑0.5－1倍。離心洗滌，加入生理鹽水或緩沖液，振蕩打碎孢子團塊，以脫脂棉過(guò)濾，計數，調整菌體濃度供誘變處理。對不產(chǎn)孢的真菌，可直接采用年幼的菌絲體進(jìn)行誘變處理。

 

4、誘變劑的種類(lèi)和選擇

A、誘變劑種類(lèi)的選擇

物理誘變劑包括：各種射線(xiàn)，如紫外線(xiàn)（焦耳）、X射線(xiàn)（庫侖/千克）、β射線(xiàn)、γ射線(xiàn)、α射線(xiàn)和超聲波等；化學(xué)誘變劑包括 甲基磺酸乙酯（EMS）、亞硝基胍、亞硝酸、氮芥等。

選擇誘變劑要根據誘變劑作用機制，結合菌種特性來(lái)考慮選擇哪種誘變劑 ，同時(shí)要考慮菌種特性和遺傳穩定性。同時(shí)還要參考出發(fā)菌株原有的誘變系譜來(lái)選擇誘變劑。對遺傳穩定的菌株，最好采用以前未使用過(guò)的、突變譜較寬的、誘變率高的強誘變劑進(jìn)行復合處理，然后再采用一些作用較緩的誘變劑處理。對遺傳不穩定的菌株，首先進(jìn)行自然分離，劃分菌落類(lèi)型，從中選擇效價(jià)高的、性能好的一類(lèi)菌落作為誘變處理的出發(fā)菌株。采用溫和誘變劑或對該類(lèi)菌劑進(jìn)行繼續處理，從中篩選突變體。并結合自然分離和環(huán)境條件的改變，使有效的菌落類(lèi)型不斷增加，成為正常型菌落。在誘變之前還要考查出發(fā)菌株的誘變系譜，詳細分析，總結規律性，選擇一種最佳的誘變劑。

B、最適誘變劑量的選擇

誘變的最適劑量，應該使所希望得到的突變株在存活群體中占有最大比例，這樣可減少以后的篩選工作。

要確定一個(gè)合適的劑量，通常要經(jīng)過(guò)多次試驗。就一般微生物而言，誘變頻率往往隨劑量的增高而增高，但達到一定劑量后，再提高劑量會(huì )使誘變頻率下降。根據對紫外線(xiàn)、x 射線(xiàn)及乙烯亞胺等誘變劑誘變效應的研究，發(fā)現正突變較多地出現在較低的劑量中。而負突變則較多地出現在高劑量中，同時(shí)還發(fā)現經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，高劑量更容易出現負突變。因此，在誘變育種工作中，目前較傾向于采用較低劑量。例如，過(guò)去在用紫外線(xiàn)作誘變劑時(shí)，常采用殺菌率為90—99.9%的劑量，而近年來(lái)則傾向于采用殺菌率為70%～75%，甚至更低(30%～70%)的劑量，特別是對于經(jīng)多次誘變后的高產(chǎn)菌株更是如此。 

化學(xué)誘變劑主要是調節濃度、處理時(shí)間和處理條件（溫度、pH等）。物理誘變劑主要控制照射距離、時(shí)間和照射過(guò)程中的條件（氧、水等），以達到最佳的誘變效果。

 

5、誘變處理

A、不同誘變處理方法

（1）紫外線(xiàn)照射

由于紫外線(xiàn)不需要特殊貴重設備，只要普通的滅菌紫外燈管即能做到，而且誘變效果也很顯著(zhù)，因此被廣泛應用于工業(yè)育種。

紫外線(xiàn)誘變育種的原理是：紫外線(xiàn)是波長(cháng)短于紫色可見(jiàn)光而又緊接紫色光的射線(xiàn)、波長(cháng)范圍為136～300nm，紫外線(xiàn)波長(cháng)范圍雖寬，但有效范圍僅限于一個(gè)小區域，多種微生物最敏感的波長(cháng)集中在265nm處，對應于功率為15W的紫外燈。它是一種非電離輻射，當物質(zhì)吸收一定能量的紫外線(xiàn)后，它的某些電子將被提升到較高的能量水平，從而引起分子激發(fā)而造成突變；而不吸收紫外線(xiàn)的物質(zhì)，能量不發(fā)生轉移，分子也不會(huì )激發(fā)，不會(huì )產(chǎn)生任何化學(xué)變化，然而，脫氧核糖核酸能大量吸收紫外線(xiàn)，因此它極容易受紫外線(xiàn)的影響而變化。紫外線(xiàn)的誘變作用是由于它引起DNA分子結構變化而造成的。這種變化包括DNA鏈的斷裂，DNA分子內和分子間的交連，核酸與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，嘧啶水合物和嘧啶二聚體的產(chǎn)生等，特別是嘧啶二聚體的產(chǎn)生對于DNA的變化起主要作用。  

紫外線(xiàn)誘變方法：將10mL菌懸液放在直徑為9cm的培養皿中，液層厚度約為2mm，啟動(dòng)磁力攪拌器，使用15w功率紫外燈管，照射距離為30cm左右，照射時(shí)間以幾秒至數十分鐘為宜，具芽孢的菌株需處理10 min左右。為準確起見(jiàn)，照射前紫外燈應先預熱20~30min，然后再進(jìn)行處理。

不同的微生物對于紫外線(xiàn)的敏感程度不一樣，因此不同的微生物對于誘變所需要的劑量也不同。在紫外燈的功率、照射距離已定的情況下，決定照射劑量的只有照射時(shí)間，這樣可以設計一個(gè)照射不同時(shí)間梯度的實(shí)驗，根據不同時(shí)間照射的死亡率，作出照射時(shí)間與死亡率的曲線(xiàn)，這樣就可以選擇適當的照射劑量。

 

一般以照射后微生物的致死率在90%~99.9% 的劑量為最佳照射劑量，近來(lái)也有傾向于采用殺菌率70%~75%甚至更低(30%~70%)的劑量。一般認為，偏低的劑量處理后正突變率較高，而用較高的劑量時(shí)則負突變率較高，但高劑量造成損傷大、回復少。目前趨向采用低劑量、長(cháng)時(shí)間處理，盡管致死率較高，而誘變效果較好。

實(shí)驗時(shí)，為了避免光復活現象，處理過(guò)程應在暗室的紅光下操作，處理完畢后，將盛菌懸液的器皿用黑布包起來(lái)培養，然后再進(jìn)行分離篩選。

 

（2）CO60 照射

CO60屬γ射線(xiàn)，是一種高能電磁波，其誘發(fā)的突變率和射線(xiàn)劑量直接有關(guān)，而與時(shí)間長(cháng)短無(wú)關(guān)。它能產(chǎn)生電離作用，直接和間接改變DNA結構。直接的效應是導致堿基的化學(xué)鍵、脫氧核糖的化學(xué)鍵、糖-磷酸相連接的化學(xué)鍵的斷裂；間接的效應是電離輻射使水和有機分子產(chǎn)生自由基，自由基作用于DNA分子，特別是對嘧啶的作用更強，可引起缺失和損傷，造成基因突變，還能引起染色體斷裂，引起倒位、缺失和易位等畸變。不同的微生物對C060的輻射敏感程度差異很大，可以相差幾倍，引起最高變異的劑量也隨菌種而有所不同。

一般照射時(shí)多采用菌懸液，也可用長(cháng)了菌落的平皿直接照射。照射劑量在4~10萬(wàn)倫琴，或者采用能使微生物產(chǎn)生90％~99％死亡率的劑量。電離幅射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復的缺失突變，但可能影響鄰近基因的性能。

 

（3）等離子輸入

等離子輸入是一種較新的誘變方法，國外自20世紀60年代中、后期相繼開(kāi)始把等離子注入技術(shù)應用于生物學(xué)領(lǐng)域的研究，國內將離子束作為一種新技術(shù)應用于生物等品種改良的研究則是由中國科學(xué)院等離子體物理研究所于1986年開(kāi)創(chuàng )的。低能離子束是以具質(zhì)量、能量雙重誘變效應的特征不同于傳統的電磁輻射，它的注入引發(fā)的生物效應，機制相當復雜，既有能量的沉積、動(dòng)量的傳遞，又有粒子的注入和電荷的交換，可導致細胞表面被刻蝕，引起細胞膜透性和膜電場(chǎng)的改良，與γ射線(xiàn)，中子束等明顯不同。離子束與生物體作用，首先有能量的沉積，即注入離子與生物大分子發(fā)生一系列碰撞，生物大分子獲得能量時(shí)，鍵斷裂，分子擊出原位，留下斷鍵或缺陷；同時(shí)還有質(zhì)量沉積，離子束是高LET粒子，有Braag峰，具有較強的電離作用，還能產(chǎn)生活性高的自由基間接損傷作用，因此它對生物體的作用可導致較高的突變率；另外由于注入離子的不同電荷數、質(zhì)量數、能量、劑量的組合，提供了眾多的誘變條件，通過(guò)這種電、能、質(zhì)的聯(lián)合作用，將強烈影響生物細胞的生理生化特性，以引起基因突變，所以變異幅度大，有較高的突變率，較廣的突變譜；再者突變體的遺傳性能比較穩定，回復突變率低。

 

B、不同誘變處理方式

①單一因子處理：采用單一誘變劑處理，可以減少減少菌種遺傳背景復雜化、菌落類(lèi)型分化過(guò)多的弊病，使篩選工作趨向簡(jiǎn)單化。

②復合因子處理：指兩種以上誘變因子共同誘發(fā)菌體突變。適合于遺傳性穩定的純種及生活能力強的菌株處理，能導致較大的突變。主要有：兩個(gè)以上因子同時(shí)處理；不同誘變劑交替處理；同一種誘變劑連續重復使用；紫外線(xiàn)復活交替處理。