植原體菌種保藏技術(shù)規程

      植原體是一類(lèi)無(wú)細胞壁的原核微生物，能侵染包括農作物、林木、花卉、雜草等植物，給農、林業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失，近年來(lái)，此類(lèi)病害在某些重要植物處于蔓延和加重的趨勢。這類(lèi)微生物尚不能在人工培養基上離體培養，其細胞結構、與寄主植物的互作等方面也有其明顯不同特點(diǎn)，研究制定此類(lèi)微生物的保藏技術(shù)規程，對于植原體菌種資源的規范和安全保藏、科學(xué)研究及合理利用具有重要意義。

 

 

1   范圍

本規程規定了植原體菌種保藏的基本原則、方法及技術(shù)要求。

本規程適用于各類(lèi)植原體菌種的保藏。

2   術(shù)語(yǔ)與定義

2.1植原體  phytoplasma

指寄生于植物韌皮部和介體昆蟲(chóng)體內的、具有三層單位膜結構的無(wú)細胞壁的原核生物。一般引起植物葉片黃化和發(fā)育畸形等癥狀。

2.2植物組織培養  plant tissue culture

在無(wú)菌的條件下，將離體的植物器官和組織在人工控制的環(huán)境下培養，使其再生形成完整植株的過(guò)程。培養植原體—植物共生體即是培養已感染植原體病菌的植物外植體。

 

3   原理

植原體菌種尚不能在離體人工培養基上培養。被感染的寄主植物攜帶植原體，因而通過(guò)對植物莖段的繁殖，即可達到對所攜帶植原體的繁殖和培養。植物組織培養和營(yíng)養繁殖，使植原體所受的選擇壓力較低，較低的溫度條件可大大減緩植物和所感染植原體的代謝活動(dòng)，從而減少菌株突變，降低繁殖速度，有效保持菌種原有性狀。

4技術(shù)要求

4.1   保藏方法

用組織培養法保藏感染植原體的植物組織，于5-25 C溫度范圍內保藏。

4.2植物組織培養基

選用適于植物組織正常生長(cháng)的培養基，不含四環(huán)素簇抗生素或其它對植原體生長(cháng)和繁殖有抑制作用的成分。

4.3   培養溫度和光照

培養溫度20-28 ℃為宜

光照強度在1000-3000  lx，光期為10-14h/d

4.4   保藏溫度和時(shí)間

常溫保藏（20-28 ℃），保藏時(shí)間1-3個(gè)月

低溫保藏（6-10 ℃），保藏時(shí)間6個(gè)月至1年。

注：保藏溫度低于4 ℃會(huì )凍傷植物組織材料而導致植原體死亡。

4.5   保藏期檢測

定期檢查保藏菌種的房間、冷庫、冰箱的溫度、濕度。

檢查各保藏試管有無(wú)雜菌污染現象，如發(fā)現雜菌污染，則取出該管重新移植，培養后補缺。

4.6移植復核

大量植原體-植物共生體進(jìn)行移植時(shí)，各菌株的編號、所用培養基需仔細核對無(wú)誤。每次移植培養后，對照原保藏的菌株和菌種順序號卡片名錄，核實(shí)無(wú)誤再行存放。

4.7     保藏指標

當獲得的組培苗表現典型癥狀或在熒光顯微鏡下觀(guān)察到特異植原體 DNA 熒光后即可進(jìn)行菌株的保藏。

5     操作方法與步驟

5.1   帶菌外植體采集

在田間采集表現典型癥狀的新鮮枝條，剪去葉和嫩稍，經(jīng)酒精和升汞等消毒劑表面消毒后，截成具節莖段，移入培養基上培養。

5.2   無(wú)雜菌組培苗的獲得

外植體長(cháng)出新枝后，選無(wú)雜菌感染的外植體，截取新枝，移入新配制的培養基上培養和繁殖。如培養基被雜菌污染，將組培苗再進(jìn)行表面消毒處理，移入新的培養基上培養，重復操作2-3次，直至獲得無(wú)雜菌組培苗為止。

5.3    組織帶菌鑒定

用DAPI熒光顯微鏡技術(shù)和PCR技術(shù)鑒定組織帶菌狀況和濃度。

DAPI熒光顯微鏡技術(shù)步驟：取植物幼莖、葉柄或根等，進(jìn)行組織切片，厚度在100mm左右，用5％戊二醛固定2小時(shí)左右，用0.1M磷酸緩沖液（pH7.0）洗滌后，用1mg  /ml  4'6－二瞇基－2－苯基吲哚（DAPI）染色，最后置于落射熒光顯微鏡下檢查韌皮部特異性植原體DNA熒光，激發(fā)濾光片波長(cháng)為365nm,阻斷濾光片波長(cháng)為420nm。

PCR技術(shù)步驟：從組織中提取植物和植原體總DNA，用植原體16S  rRNA等基因序列的引物進(jìn)行PCR基因擴增，然后進(jìn)行瓊脂糖電泳，檢測特異性擴增產(chǎn)物譜帶。

5.4  常溫保藏

植原體-植物共生體在適宜的組織培養基上培養，并正常溫度和光照下（20-28 C，光照強度在1000-3000  lx）進(jìn)行保藏，保藏周期為1-3個(gè)月。

5.5   低溫保藏

將正常溫度和光照下（20-28 C，光照強度在1000-3000  lx）培養的植原體-植物共生體移入含組織培養基的試管內，移入6-10 C低溫冷藏柜內保藏，1-2個(gè)月將試管暴露于正常培養溫度和光照條件下補光2-3天，然后存放于低溫冷藏柜繼續保藏，保藏周期為6個(gè)月至1年以上。