發(fā)根農桿菌對植物的Ri質(zhì)粒轉化與表達(二)

本實(shí)驗正是通過(guò)A₄發(fā)根農桿菌的介導，對煙草、油菜、甘藍等植物進(jìn)行基因的改造，得到它們的發(fā)狀根。

1菌種：發(fā)根農桿菌A4 （抗利福霉素）

2器材：超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、光照培養箱、恒溫震蕩搖床、pH酸度計、電子天平、培養皿（6-9cm）若干套、1000ml燒杯2只、容量瓶（10、50、100、500、1000ml）各1只，三角瓶（100ml）20只，玻璃棒若干只，酒精燈一只，鋁箔、稱(chēng)量紙、長(cháng)剪刀、解剖刀、長(cháng)鑷子、接種針、移液槍?zhuān)?0、200、1000μl）各1只

 

3藥品：

配制MS植物基本培養基藥品：NH₄NO₃ 、KNO₃ 、CaCl₂ 、MgSO₄7H₂O、 KH₂PO 、KI、H₃BO₃ 、MnSO₄.7H₂O、 ZnSO₄.2H₂O、Na₂MoO₄.2H₂O、 CuSO₄.5H₂O、CoCl₂.6H₂O、CoSO₄.7H₂O、 FeSO₄.7H₂O、Na₂.EOTA.2H₂O、肌醇、煙酸、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、甘氨酸、蔗糖、瓊脂

配制LB細菌培養基藥品：胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、瓊脂

抗生素藥品：利福霉素、氨芐青霉素、頭孢霉素

 

1、植物無(wú)菌外植體的獲得：

將實(shí)驗的最初種子材料包于醫用紗布，用自來(lái)水沖洗過(guò)夜后用無(wú)菌水漂洗三次，浸入75%乙醇表面處理1分鐘，再用10%NaClO表面消毒10-15分鐘，經(jīng)無(wú)菌水漂洗5次后接種于盛有無(wú)激素MS固體基本培養基（MS₀）的培養皿中，28℃下暗培養。及時(shí)將未污染的發(fā)芽種子轉接到盛有MS₀固體培養基的培養皿中繼續28℃光照培養，一周后可得到無(wú)菌種子幼苗。然后將幼苗轉接到盛有MS₀固體培養基的的100ml三角瓶中28℃光照培養15-20天，得到無(wú)菌種子苗植株。

2、A₄發(fā)根農桿菌純化篩選極其工程菌液的制備

將A₄發(fā)根農桿菌原種接入LB液體培養基中28℃搖床擴增培養40-50小時(shí)，以0.3ml的接種量平鋪接種于含有利福霉素40mg/L的固體LB平板培養基上（9cm培養皿），28℃ 培養60-80小時(shí)進(jìn)行菌種的純化篩選。將純化篩選得到的A₄發(fā)根農桿菌單菌落接種于LB液體培養基中增殖培養40-50小時(shí)至光密度達到0.5，制備成工程菌液。

3、 A₄發(fā)根農桿菌對外植體侵染誘導產(chǎn)生發(fā)狀根

切取無(wú)菌苗的下胚軸及葉片，將其倒置接于MS₀固體培養基上（使切口向上），用移液槍吸取工程菌液輕點(diǎn)接菌在下胚軸及葉片葉柄的切口上（同時(shí)以移液槍吸取無(wú)菌水輕點(diǎn)接在下胚軸及葉片葉柄的切口做為對照），暗培養2-3天后轉到含有500 mg/L頭孢霉素的固體MS₀培養基上繼代培養7-14天后從切口、胚軸及葉脈等處均可誘導出大量的發(fā)狀根。

4、 Ri-質(zhì)粒轉化的初步判斷

根據發(fā)狀根的幾項重要的生物學(xué)特性來(lái)初步判斷Ri-質(zhì)粒轉化（一）發(fā)狀根的發(fā)生多在母體植物的不定部位。通過(guò)A₄發(fā)根農桿菌侵染，以在葉片上特別是葉片無(wú)切傷處生出的不定根判斷極有可能是Ri-質(zhì)粒轉化得到的發(fā)狀根，切取其進(jìn)行除菌，并進(jìn)行進(jìn)一步驗證。（二）發(fā)狀根多表現為較弱的向地性。以對照的生出的不定根與侵染后葉片無(wú)切傷處生出的不定根做比較。對照生出的不定根在母體上具有很強的向地生長(cháng)現象，而侵染后葉片無(wú)切傷處生出的不定根無(wú)論在母體外植體上還是離體培養中都應表現出很弱或不表現向地生長(cháng)的現象。以此來(lái)對侵染后葉片無(wú)切傷處生出的不定根做進(jìn)一步的判定。（三）由于轉入植物的T-DNA在植物細胞中可表達產(chǎn)生植物激素，因而發(fā)狀根在無(wú)激素的培養基上生長(cháng)正常以及較快。同樣以對照生出的不定根與侵染后葉片無(wú)切傷處生出的不定根做比較。對照的生出的不定根剛離體后在MS₀培養基上生長(cháng)極為緩慢甚至停止生長(cháng)；葉片侵染后無(wú)切傷處生出的不定根離體后在MS₀培養基上繼代多次后仍然生長(cháng)較快。由上可初步判斷葉片侵染后無(wú)切傷處生出的不定根是Ri-質(zhì)粒轉化得到的發(fā)狀根。

5、 發(fā)狀根的除菌及其固體培養體系的建立

要建立起正常的發(fā)狀根培養體系必須經(jīng)過(guò)除菌獲得無(wú)菌的發(fā)狀根。以抗生素除菌和溫度除菌相結合的方法進(jìn)行除菌�？股�素除菌，即將發(fā)狀根從母體上切下后移植到含有抗生素的培養基上，經(jīng)數代轉移直到完全無(wú)菌為止。溫度除菌，即將發(fā)狀根從母體上切下后移植到不含有抗生素的培養基上，在 39-40℃溫度條件下處理2天后再移到28℃下培養，發(fā)狀根恢復生長(cháng)而細菌不在生長(cháng)，完全達到除菌的目的。由于新生的發(fā)狀根前端細菌較少，因而除菌時(shí)將培養的發(fā)狀根前端及時(shí)地剪切下來(lái)轉移到新的培養基上，將極大的有利于細菌的去除。

經(jīng)2-3次抗生素與溫度的結合除菌，得到的煙草發(fā)狀根細菌完全除凈且在MS₀固體培養基上生長(cháng)正常，每4-5周可繼代1次。

6、 發(fā)狀根液體培養體系的建立

 將已經(jīng)過(guò)除菌的各發(fā)狀根株系在MS₀固體培養基上擴增培養并篩選，篩選生長(cháng)正常且生物量增長(cháng)快的株系進(jìn)行繼代擴增至一定的生物量后轉入盛有MS₀液體培養基的250ml三角瓶中28℃搖床暗培養，搖床轉速120rpm，培養20-30天即可得到一系列煙草發(fā)狀根液體培養體系。

 

附錄：

（1）LB細菌培養基配制方法

配制每升培養基，應在950ml去離子水中加入：

細菌培養用胰化蛋白胨（bacto—tryptone）：10g

細菌培養用酵母提取物（bacto— yeast extract）：5g

NaCl：10g

搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，用5mol/L NaOH（約0.2ml）調節pH值至7.0，加入去離子水至總體積為1L，在15 lbf/in²(1.034x10⁵Pa)高壓下蒸汽滅菌20分鐘。

（2）MS植物基本培養基配方表