發(fā)根農桿菌對植物的Ri質(zhì)粒轉化與表達（一）

     轉基因植物在近代工業(yè)、醫藥業(yè)、特別是農業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域的研究和應用越來(lái)越為人類(lèi)所重視。通過(guò)農桿菌對植物植株、器官、組織及細胞的侵染進(jìn)行質(zhì)粒轉化，是將外源基因導入目的植物的重要方法之一。本實(shí)驗使同學(xué)了解農桿菌對植物質(zhì)粒轉化的基本原理及具體操作過(guò)程，從而對轉基因植物的產(chǎn)生和外源基因轉入植物后產(chǎn)生的特殊性狀具有更加感性的認識。

      將外源基因人為導入天然植物中，從遺傳物質(zhì)水平上對植物進(jìn)行有目的改造，由此獲得轉基因植物，其性狀將按著(zhù)有利于人們需要的方向發(fā)生改變。如轉基因的抗蟲(chóng)棉花，通過(guò)人們的改造，使棉花在生長(cháng)過(guò)程中體內能夠自主地產(chǎn)生抵抗害蟲(chóng)的毒素，以達到自我保護、減少農藥使用增產(chǎn)增收的目的。

   隨著(zhù)科學(xué)家的不斷探索，將人們獲得的有用基因轉入目的植物方法發(fā)展較快，現有農桿菌介導法、基因槍轟擊法、細胞顯微注射法、花粉管真空滲透法、化學(xué)法及電穿孔法等，其中農桿菌介導法是今仍然廣泛使用的一種有效轉化方法。農桿菌介導法所使用的質(zhì)粒載體分根癌農桿菌和發(fā)根農桿菌兩大類(lèi)。

通過(guò)發(fā)根農桿菌的侵染向目的植物轉入Ri質(zhì)粒中的T-DNA，可使培養植物發(fā)生變態(tài)性的生長(cháng)，專(zhuān)一性生長(cháng)毛狀的發(fā)狀根。通過(guò)植物基因改造獲得的發(fā)狀根生長(cháng)迅速且培養時(shí)不需要添加外源激素，同時(shí)發(fā)狀根擁有親本植株的特征次級代謝途徑和遺傳穩定性，幾乎無(wú)培養的退化問(wèn)題，這些特點(diǎn)對植物生物工程的研究與應用具有重要的現實(shí)意義，例如通過(guò)發(fā)狀根培養來(lái)生產(chǎn)只有在高度的根趨向分化細胞中才能產(chǎn)生的有用次生代謝物質(zhì)等。

 發(fā)根農桿菌是一種寄主非常廣泛的土壤細菌，能夠浸染幾乎所有的雙子葉和少數的單子葉植物。其有不同的菌株，各自對一些相應的植物品種具有較強的侵染性，如A4 9402 Ar.15834等。發(fā)根農桿菌感染植物傷口，經(jīng)一段時(shí)間后被感染的植物會(huì )在不定的部位生出發(fā)狀根。發(fā)狀根沒(méi)有向地性，可在無(wú)激素的培養基上培養生長(cháng)，生長(cháng)迅速并產(chǎn)生許多分枝，其增長(cháng)速度一個(gè)月可增殖數倍到數百倍。發(fā)根農桿菌對植物的這種作用主要依賴(lài)于其菌體中的Ri質(zhì)粒。

Ri質(zhì)粒具有普通的質(zhì)粒的特點(diǎn)：是細菌染色體外的遺傳物質(zhì)，能獨立復制，為閉合環(huán)狀雙鏈DNA。它是非必要的遺傳物質(zhì)，一般控制細菌的次要性狀，可自我復制并具有遺傳的穩定性，在特殊環(huán)境中對細菌的生存起著(zhù)重要的作用。它具有可轉移性、可重組性、可整合性、可消除性等特點(diǎn)。Ri質(zhì)粒的環(huán)狀基因可按功能可分為Vir、T-DNA、Ori三個(gè)區，該三個(gè)功能區在對植物的浸染與表達中分工明確。

Vir區的作用：該區基因不發(fā)生轉移，但它在T-DNA轉移的過(guò)程中起著(zhù)十分重要的作用，這個(gè)區的缺矢或突變會(huì )使發(fā)根農桿菌的菌株喪失對植物的侵染能力。Vir區7個(gè)基因群（A-G）的A一直處于活性表達狀態(tài)而其它的6個(gè)基因通常情況下處于抑制狀態(tài)。發(fā)根農桿菌感染寄主時(shí)，被損傷的植物細胞會(huì )合成特殊的小分子酚類(lèi)化合物乙酰丁香酮等，此時(shí)其可以與Vir區A基因的表達產(chǎn)物結合，誘導其它的聯(lián)合基因的活化，從而發(fā)生感染過(guò)程。

T-DNA區的特點(diǎn)與功能：T-DNA區的基因群具有致使發(fā)狀根產(chǎn)生（包括生長(cháng)素合成）的有關(guān)基因、冠癭堿合成的有關(guān)基因以及某些抗性標記基因和特殊的酶切位點(diǎn)。其在侵染的過(guò)程中轉移到寄主的細胞中與其DNA相整合，從而隨寄主細胞中的DNA進(jìn)行復制和表達。由于真核細胞中才具有T-DNA區的基因群中某些基因（如生長(cháng)素合成的有關(guān)基因、冠癭堿合成的有關(guān)基因等）的功能啟動(dòng)子，因而這些基因只能在寄主真核細胞中轉錄表達，在農桿菌中處于抑制狀態(tài)。

Ori區的功能：在農桿菌中啟動(dòng)質(zhì)粒DNA的復制。

發(fā)根農桿菌將T-DNA轉入寄主的過(guò)程：首先受傷的植物從傷口處產(chǎn)生特殊的小分子酚類(lèi)化合物乙酰丁香酮等，與Vir區A基因的表達產(chǎn)物結合，誘導其它的聯(lián)合基因的活化，從而發(fā)生感染過(guò)程，T-DNA區的兩端先后單鏈短裂，短裂下來(lái)的單鏈T-DNA被轉移到植物細胞中與植物的基因組隨機的整合，Ri質(zhì)粒中移走的T-DNA區通過(guò)DNA復制得到修復，因此盡管發(fā)生了單鏈T-DNA的轉移，發(fā)根農桿菌細胞沒(méi)有因此喪失任何遺傳信息。

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