微生物培養基質(zhì)控與圖解——培養基的高壓滅菌及效果驗證

第三節  培養基的高壓滅菌及效果驗證

 

    消毒滅菌在醫學(xué)實(shí)踐上有著(zhù)重要意義。它可切斷傳播途徑、控制感染擴散造成的危害；也可殺滅物品或器皿上的細菌，防止醫院感染；在醫學(xué)微生物檢驗的領(lǐng)域中，消毒滅菌是保正感染的病原學(xué)檢驗不受外來(lái)微生物污染的前提。

    （一）術(shù)語(yǔ)

    消毒( disinfection)、火菌(sterilization)、抑菌(bacteriostasis)、防腐（antisepsis）和無(wú)菌( asepsis)是常用術(shù)語(yǔ)。下面就術(shù)語(yǔ)概念加以敘述。

    (1)滅菌。是用適當的物理或化學(xué)手段將物品中活的微生物殺滅或除去的方法。本法適用于制劑、原料、輔料及醫療器械等物品的滅菌。（如外科器械、注射器、基礎培養基滅菌等。）

    (2)消毒。是破壞物體上活的病原微生物的方法，但不包括細菌芽胞和非病原微生物。如用酒精溶液浸泡體溫計、新潔爾滅液擦拭檢查臺等。用于消毒的化學(xué)物品稱(chēng)消毒劑( dis-infectant)。一般而言，消毒對象是指物體而不是機體。

    (3)防腐。直接使用防腐劑(antiseptics)破壞或抑制活的病原微牛物的方法。如外科手術(shù)前碘液擦洗皮膚、雙氧水清創(chuàng )傷口或殺菌肥皂清冼雙手等。

    (4)無(wú)菌。防止感染病原體進(jìn)入滅菌組織或物品的操作技術(shù)稱(chēng)無(wú)菌操作。無(wú)菌即為不存在活的微生物。

    用于消毒滅菌的物理方法有熱力、電離輻射、超聲波、過(guò)濾等。這里介紹熱力消毒滅菌法。高熱破壞微生物蛋白質(zhì)、核酸、細胞壁和細胞膜，從而導致微生物死亡。受高熱作用后，蛋白質(zhì)分子運動(dòng)加快，肽鏈連接鍵斷裂，蛋白變性凝固；細胞膜功能受損使胞內物質(zhì)漏出，細菌內外環(huán)境平衡失調。

    不同種類(lèi)微生物對熱的耐受力不同，多數無(wú)芽胞細菌經(jīng)55-60℃作用30-60分鐘后死亡，100℃時(shí)迅速死亡。有芽胞細菌則對高溫有強的抵抗力，如肉毒芽胞梭菌煮沸需3—5小時(shí)才死亡。

    熱力滅菌分干熱滅菌法和濕熱滅菌法兩大類(lèi)，相同溫度下后者較前告效力大，其原因

是：①濕熱環(huán)境中菌體蛋白易凝固；②濕熱穿透力比干熱大；③濕熱蒸氣變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可釋放潛熱，迅速提高被滅菌物體的溫度。

    1．干熱（dry heat）滅菌法

(1)焚燒。直接點(diǎn)燃或在焚燒爐內進(jìn)行，僅適用于廢棄物品或動(dòng)物尸體。

(2)燒灼。直接以火焰滅菌，適用于微生物學(xué)實(shí)驗室接種環(huán)、針和試管口等滅菌。

    (3)干烤。在干烤箱內進(jìn)行，加熱至150-180℃ 2-4小時(shí)達到滅菌效果，適用于高溫下不變質(zhì)、不被破壞和不蒸發(fā)的物品，如玻璃器皿、瓷器，不能用于塑料、棉、紙制品。

    2．濕熱( moist heat)消毒滅菌法

    (1)巴氏消毒法。巴氏消毒法(pasteurization)是用較低溫度殺滅液體中的病原微生物或特定微生物而保持物品中所需的不耐熱成分的方法。此法由巴斯德創(chuàng )立，用于酒類(lèi)消毒而得名。目前用于牛乳消毒。方法有兩種：一種為71.6℃加熱15秒，另一種為63-66℃加熱30分鐘。大多采用第一種方法。

    (2)煮沸法。在1個(gè)大氣壓下，水煮沸后溫度達100℃，煮沸5分鐘后可殺死一般細菌繁殖體。如于水中加入2%碳酸鈉，可將其沸點(diǎn)提高至105℃，既可促進(jìn)芽胞的殺滅，又可防止金屬器皿生銹。

    (3)流通蒸氣消毒法。又稱(chēng)常壓蒸氣消毒法，常用附諾(Amold)流通蒸氣滅菌器，利用1個(gè)大氣壓下100℃水蒸氣進(jìn)行消毒，10-30分鐘后細菌繁殖體被殺死，但對芽孢作用不大。

    (4)間歇滅菌法（fractional sterilization）。采用間歇方式達到滅菌目的。將滅菌物品置于阿諾流通蒸氣滅菌器內，100℃加熱15-30分鐘，每日1次，連續3次。每次滅菌后取出物品置37℃孵育箱過(guò)夜，致殘存的芽胞發(fā)育成繁殖體，次日再通過(guò)流通蒸氣滅菌器加熱而被殺滅。如此反復，既可殺滅芽胞，又可使不耐高溫的物質(zhì)免受影響。若某些物質(zhì)不耐100攝氏度，則可將溫度下降至75-80℃，每次加熱時(shí)間延長(cháng)到30-60分鐘，常用血清凝固器對呂氏血清培養基和L-J培養基的滅菌屬此方法。

    (5)高壓蒸氣火菌法。利用密閉的耐高壓蒸氣滅菌器(autoclave)，在蒸氣不外溢的條件下，使鍋內壓力增高，隨之蒸氣溫度也增高。通常在103.4kPa壓力下蒸氣溫度達到121.3℃，維持15-20分鐘，可殺滅所有的繁殖體和芽胞。本法適用于耐高溫、耐濕物品的滅菌，如普通培養基、生理鹽水、手術(shù)敷料等。

    （二）下向主要介紹高壓蒸氣滅菌器滅菌效果的驗證方法

    高壓蒸氣滅菌器使物品滅菌后達到無(wú)菌要求，這是藥品實(shí)驗中的基本保證。高壓滅菌器滅菌效果是否合格足實(shí)驗成敗的最基礎最關(guān)鍵的首要步驟。除少數培養基只需加熱溶解，不需高壓滅菌外，大部分培養基均需121℃高壓滅菌15-30分鐘。尤其是對無(wú)菌試驗培養基滅菌不徹底，直接關(guān)系到對藥品的無(wú)菌試驗結果。因此必須認真對高壓滅菌器進(jìn)行滅菌效果的驗證。為此我們提供了進(jìn)行滅菌效果驗證的一個(gè)簡(jiǎn)易可行的方法。

    1．試驗材料

(1)嗜熱脂肪芽胞桿菌紙片。嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus  stearothermophilus)

ATCC7053是本法常用的生物指示菌，含芽胞量5-lO⁵ CFU/片。

    (2) 121℃壓力蒸氣滅菌化學(xué)指示卡。

    (3)溴甲酚紫胨水培養基116℃高壓滅菌20分鐘后備用。

    (4)O—150℃留點(diǎn)溫度計。

    2．方法與結果

    將嗜熱脂肪芽胞桿菌紙片（以下簡(jiǎn)稱(chēng)菌片）用無(wú)菌鑷子放人密封試管中�；瘜W(xué)指示卡和留點(diǎn)溫度計放入敞口試管中。以上兩種試管各準備5-10份。分別放置在高壓滅菌器蒸氣口處、底部排氣口處及底部出水口處或上下左右中間5處。如滅菌器為二層，則需放10處。

    留點(diǎn)溫度計標化合格后方可用于驗證試驗。檢測前，需將溫度計的水銀柱甩至40℃以下。每次監測后留點(diǎn)溫度計的溫差應存l℃之間，則說(shuō)明滅菌器內的溫度分布是均勻的。

    滅菌后的菌片應在嚴格無(wú)菌操作條件下放入滅菌后的溴甲酚紫胨水培養基內56-60℃培養24-48小時(shí)，觀(guān)察顏色變化。如培養基變?yōu)辄S色，說(shuō)明菌片中的嗜熱脂肪芽胞桿菌尚未完全滅活，細菌仍可在培養基中生長(cháng)，分解葡萄糖產(chǎn)酸變?yōu)辄S色。如培養基顏色不變化仍為紫色，則說(shuō)明芽胞已滅活。同時(shí)要用未經(jīng)滅菌的紙片放入培養基內作為陽(yáng)性對照，不加紙片的空白培養基作為陰性對照。

    化學(xué)指示卡上的指示色塊，在高壓蒸氣滅菌時(shí)，由淡黃色變?yōu)楹谏�。隨著(zhù)顏色變化的深淺，并與對照色相比，可判斷滅菌效果是否達到要求�；瘜W(xué)指示卡應在干燥處保存。遇潮會(huì )變色，影響滅菌效果的觀(guān)測。

    高壓蒸氣滅菌必須使蒸氣順利進(jìn)入滅菌器內，與滅菌物品接觸，并將原有的冷空氣排出方可達到滅菌的效果。要進(jìn)行空載熱分布和滿(mǎn)載熱穿透力驗證(滿(mǎn)載時(shí)不超過(guò)總體積的2/3)。二種驗證各重復三次，共做六次。

    5個(gè)點(diǎn)六次試驗表明溫度均在121℃，化學(xué)指示卡變黑；程度與對照色一致；培養基均未改變顏色，說(shuō)明高壓蒸氣滅菌效果合格。

    高壓滅菌器屬于強檢儀器，但強檢只是對儀器物理參數的考核。所以做過(guò)強檢的滅菌器還必須進(jìn)行滅菌效果的驗證。一些單位常常忽略了這個(gè)重要的問(wèn)題。國內市售的手提滅菌器，往往儀器指針達到所需的溫度，但滅菌物品的實(shí)際溫度卻未達到要求。導致滅菌物品不徹底，影響實(shí)驗結果。培養基滅菌不徹底，影響培養基的使用及結果判斷。因此高壓蒸氣滅菌器無(wú)菌效果的驗證是一個(gè)必須引起重視的問(wèn)題。

（三）滅菌時(shí)的注意事項

    使用高壓蒸氣滅菌器時(shí)，首先應注意在開(kāi)放蒸氣的同時(shí)，排除滅菌器內的冷空氣。必須將器內冷空氣全部排除后，才可關(guān)閉排氣孔。假如滅菌器內仍存留有部分空氣時(shí)，剛壓力表上雖已達到了某一壓力值，但器內之溫度仍未達到相應之度數。存留的空氣越多，剛二者相差也越大。差也越大，器內溫度不足，滅菌則不徹底。

表蒸汽壓力與溫度的關(guān)系

 

 

表 高壓蒸汽滅菌器中溫度與冷空氣排出量的關(guān)系