微生物基因表達的調控

目前常用的三種體外 DNA 連接方法為：

① 用 T4或 E.coli DNA連接酶可連接具有互補粘性末端的 DNA片段；

② 用 T4 DNA連接酶連接具有平末端的 DNA 片段；

③ 先在 DNA 片段末端加上人工接頭，使其形成粘性末端，然后再行連接。

④ 將粘性末端補平或修平（用單鏈酶，如綠豆芽核酸酶）連接

 

柯斯質(zhì)粒用于克隆大片段的 DNA分子特別有效，而這種特性對于研究高等生物的基因組十分重要。其特點(diǎn)： 

1）具有 λ噬菌體的特性：在克隆了外源片段后可在體外被包裝成噬菌體顆粒，高效地感染對 λ噬菌體敏感的大腸桿菌細胞。進(jìn)入寄主的柯斯質(zhì)粒 DNA分子，按照 λ 噬菌體 DNA的方式環(huán)化， 但無(wú)法按噬菌體的方式生活，更無(wú)法形成子代噬菌體顆粒。 

2）具有質(zhì)粒載體的特性：在寄主細胞內如質(zhì)粒一樣進(jìn)行復制，攜帶有抗性基因和克隆位點(diǎn)，并具氯霉素擴增效應。 

3）具有高容量的克隆能力：柯斯質(zhì)粒本身一般只有 5～7kb左右，而它克隆外源 DNA 片段的極限值竟高達 45kb，遠遠超過(guò)質(zhì)粒載體及 λ 噬菌體載體的克隆能力。同時(shí)，由于包裝限制，  柯斯質(zhì) 粒載體的克隆能力還存在一個(gè)最低極限值。  例如，5 kb大小的 柯斯質(zhì)粒載體，插入的外源片段至少不能小于 30 kb。 

 

M13是大腸桿菌絲狀噬菌體，其基因組為環(huán)狀 ssDNA，  大小為 6407bp。其生活史為： 

1）通過(guò)性毛感染雄性（F+或 Hfr）大腸桿菌，或通過(guò)轉染進(jìn)入雌性大腸桿菌細胞； 

2）進(jìn)入細胞后，轉變成復制型  (RF)  dsDNA，然后以滾環(huán)方式制出 ssDNA。每當復制出單位長(cháng)度正鏈，即被切出和環(huán)化，并被立即組裝成子代噬菌體和以出芽方式（即宿主細胞不被裂解）被釋放至胞外。 

M13克隆載體是對野生型 M13進(jìn)行改造后建成，其特點(diǎn)是雖然克隆外源 DNA的能力較小，一般只適于克隆 300～400bp 的外源 DNA 片段，但特別適合用于制備克隆基因的單鏈 DNA。主要被用于制備測序用單鏈 DNA模板、特異的單鏈 DNA探針，進(jìn)行定位誘變等，也可用于噬菌體展示。