微生物限度檢查法系檢查非規定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細菌數、霉菌數、酵母菌數及控制菌檢查。
微生物限度檢查應在環(huán)境潔凈度10000 級下的局部潔凈度100 級的單向流空氣區域內進(jìn)行。檢驗全過(guò)程必須嚴格遵守無(wú)菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區域、工作臺面及環(huán)境應定期按《醫藥工業(yè)潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》 的現行國家標準進(jìn)行潔凈度驗證。
供試品檢查時(shí)．如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應證明其有效性及對微生物無(wú)毒性。
除另有規定外，本檢查法中細菌及控制菌培養溫度為30～35 ℃ ；霉菌、酵母菌培養溫度為23～28 ℃ 。
檢驗結果以1g 、lml 、10g 、l0ml 或10cm2 為單位報告，特殊品種可以最小包裝單位報告。
檢驗量
檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g 、ml 或cm2）。
除另有規定外，一般供試品的檢驗量為10g 或10ml；膜劑為100 cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門(mén)菌的供試品，其檢驗量應增加20g 或20ml （其中10g或10ml 用于陽(yáng)性對照試驗）。
檢驗時(shí),應從2 個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少于4 片。
一般應隨機抽取不少于檢驗用星（兩個(gè)以上最小包裝單位）的3 倍最供試品。
供試液的制備
根據供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時(shí)，應均勻加熱，且溫度不應超過(guò)45℃ 。供試液從制備至加入檢驗用培養基，不得超過(guò)1 小時(shí)。
除另有規定外，常用的供試液制備方法如下。
1.液體供試品
取供試品10ml ，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml ，混勻，作為l:10 的供試液。油劑可加入適量的無(wú)菌聚山梨酯80 使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。
2.固體、半固體或黏稠性供試品
取供試品10g ，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至1OOml ，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1:10 的供試液。必要時(shí)加適量的無(wú)菌聚山梨酯80 ，并置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。
3.需用特殊方法制備供試液的供試品
（1）非水溶性供試品
方法1 取供試品5g（或5ml ) ，加至含溶化的（溫度不超過(guò)45℃ ）5g司盤(pán)80 、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80 無(wú)菌混合物的燒杯中，用無(wú)菌玻棒攪拌成團后，慢慢加人45 ℃ 的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml ，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1 : 20 的供試液。
方法2 取供試品10g ，加至含20ml 無(wú)菌十四烷酸異丙酯（制法見(jiàn)附錄XII A 無(wú)菌檢查法中供試品的無(wú)菌檢查項下）和無(wú)菌玻璃珠的適宜容器中．必要時(shí)可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45 ℃ 的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10Oml ，振搖5～10 分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為l : 10 的供試液。
（2）膜劑供試品
取供試品100cm2，剪碎，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml （必要時(shí)可增加稀釋液），浸泡，振搖，作為1:10 的供試液。
（3）腸溶及結腸溶制劑供試品
取供試品10g ，加pH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或pH7.6 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（用于結腸溶制劑）至100ml ，置45 ℃ 水浴中，振搖，使溶解，作為1 :10 的供試液。
（4）氣霧劑、噴霧劑供試品
取規定量供試品，置冰凍室冷凍約1 小時(shí)，取出，迅速消毒供試品開(kāi)啟部位，用無(wú)菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無(wú)菌注射器吸出全部藥液，加至適量的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（若含非水溶性成分，加適覺(jué)的無(wú)菌聚山梨酯80 ）中，混勻，取相當于10g或10ml 的供試品，再稀釋成1:10 的供試液。
（5）貼劑供試品
取規定量供試品，去掉貼劑的保護層，放置在無(wú)菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無(wú)菌多孔材料（如無(wú)菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面，以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩至少30 分鐘，制成供試液。貼劑也可采用其他適宜的方法制備成供試液。
（6）具抑菌活性的供試品
當供試品有抑菌活性時(shí)，采用下列方法進(jìn)行處理，以消除供試液的抑菌活性，再依法檢查。常用的方法如下。
① 培養基稀釋法 取規定量的供試液，至較大量的培養基中，使單位體積內的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數時(shí)，取同稀釋級的供試液2ml ，每1ml供試液可等量分注多個(gè)平皿，傾注瓊脂培養基，混勻，凝固，培養，計數。每1ml供試液所注的平皿中生長(cháng)的菌落數之和即為1ml的菌落數，計算每1ml供試液的平均菌落數，按平皿法計數規則報告菌數；控制菌檢查時(shí)，可加大增菌培養基的用量。
② 離心沉淀法 取一定量的供試液，500 轉／分鐘離心3 分鐘，取全部上清液混合。用于細菌檢查。
③ 薄膜過(guò)濾法 見(jiàn)細菌、霉菌及酵母菌計數項下的“薄膜過(guò)濾法”。
④ 中和法 凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養基中。
細菌、霉菌及酵母菌計數
計數培養基的適用性檢查
細菌、霉菌及酵母菌計數用的培養基應進(jìn)行培養基的適用性檢查，成品培養基、由脫水培養基或按處方配制的培養基均應檢查。
菌種
試驗用菌株的傳代次數不得超過(guò)5 代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。
大腸埃希菌（Escherichia coli[CMCC ( B ) 44l02]
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[ CMCC ( B ) 26003 ]
枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis ) [ CMCC ( B ) 63501 ]
白色念珠菌（Candida albicans ）〔 CMCC ( F ) 98001 〕
黑曲霉（Aspergillus niger) [ CMCC ( F ) 98003 ]
菌液制備
接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養物至營(yíng)養肉湯培養基中或營(yíng)養瓊脂培養基上，培養18 ～24 小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，培養24～48 小時(shí)。上述培養物用0 . 9 ％無(wú)菌氯化鈉溶液制成每lml 含菌數為50～100CFU 的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，培養5 ～7 天，加人3 ～5ml 含0.05 % ( ml /ml ）聚山梨酯80 的0.9 ％無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內，用含0.05 % ( ml / ml ）聚山梨酯80 的0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液制成每lml 含孢子數50 ～ 100CFU 的孢子懸液。
菌液制備后若在室溫下放置，應在2 小時(shí)內使用；若保存在2～8 ℃ ，可在24 小時(shí)內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2 ～8 ℃ ，在驗證過(guò)的貯存期內使用。
適用性檢查
取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌各50～100CFU ，分別注入無(wú)菌平皿中，立即傾注營(yíng)養瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2 個(gè)平皿，混勻，凝固，置30～35 ℃ 培養48 小時(shí)，計數；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100CFU ，分別注入無(wú)菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2 個(gè)平皿，混勻，凝固，置23 ～28 ℃ 培養72 小時(shí)，計數；取白色念珠菌50 ～100CFU ，注入無(wú)菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基．平行制備2 個(gè)平皿，混勻，凝固，置23 ～28 ℃ 培養72 小時(shí)，計數。同時(shí)，用相應的對照培養基替代被檢培養基進(jìn)行上述試驗。
結果判定
若被檢培養基上的菌落平均數不小于對照培養基上的菌落平均數的70 % ，且菌落形態(tài)大小與對照培養基上的菌落一致，判該培養基的適用性檢查符合規定。
計數方法的驗證
當建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時(shí)，應進(jìn)行細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該產(chǎn)品的細菌、霉菌及酵母菌數的測定。若產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結果時(shí)，計數方法應重新驗證。
驗證時(shí)，按供試液的制備和細菌、霉菌及酵母菌計數所規定的方法及下列要求進(jìn)行。對各試驗菌的回收率應逐一進(jìn)行驗證。
菌種及菌液制備
同計數培養鑒的適用性檢查。
驗證方法
驗證試驗至少應進(jìn)行3 次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。
( l )試驗組 平皿法計數時(shí)，取試驗可能用的最低稀釋級供試液lml 和50 ～100CFU 試驗菌，分別注人平皿中，立即傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2 個(gè)平皿，按平皿法測定其菌數。薄膜過(guò)濾法計數時(shí)，取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加人50～100CFU 試驗菌，過(guò)濾，按薄膜過(guò)濾法測定其菌數。
( 2 )菌液組 測定所加的試驗菌數。
( 3 )供試品對照組 取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。
( 4 )稀釋劑對照組 若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過(guò)濾等特殊處理時(shí)，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過(guò)程中微生物受影響的程度。試驗時(shí)，可用相應的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每lml 供試液含50 ～100CFU ，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數。
結果判斷
在3 次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌數回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）應均不低于70 % 。若試驗組的菌數回收率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值占菌液組的平均菌落數的百分率）均不低于70％，照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數；若任一次試驗中試驗組的菌數回收率低于70 % ，應采用培養基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過(guò)濾法、中和法（常見(jiàn)干擾物的中和劑或滅活方法見(jiàn)表1 ）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗證。
表l 常見(jiàn)干擾物的中和劑或滅活方法
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干擾物 |
可選用的中和劑或滅活方法 |
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戊二醛 |
亞硫酸氫鈉 |
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酚類(lèi)、乙醇、吸附物 |
稀釋法 |
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醛類(lèi) |
稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽 |
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季銨類(lèi)化合物（QACs ）、對羥基苯甲酸酯 |
卵磷脂、聚山梨酯
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汞類(lèi)制劑 |
亞硫酸氫鈉、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽 |
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雙胍類(lèi)化合物 |
卵磷脂 |
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碘酒、洗必泰類(lèi) |
聚山梨酯 |
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鹵化物 |
硫代硫酸鹽 |
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乙二胺四乙酸（EDTA ) |
鎂或鈣離子 |
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磺胺類(lèi) |
對氨基苯甲酸 |
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β-內酰胺類(lèi)抗生素 |
β-內酰胺酶 |
若沒(méi)有適宜的方法消除供試品的抑菌活性，那么驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時(shí)表明該供試品不能被試驗菌污染。但是，供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒(méi)有抑制作用。因此，根據供試品須符合的微生物限度標準和菌數報告規則，在不影響檢驗結果判斷的前提下，應采用能使微生物生長(cháng)的更高稀釋級的供試液進(jìn)行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進(jìn)行供試品檢驗。
計數方法驗證時(shí)，采用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求，那么選擇回收率最接近要求的方法和試驗條件進(jìn)行供試品的檢驗。
驗證試驗也可與供試品的細菌、霉菌及酵母菌計數同時(shí)進(jìn)行。
供試品檢查
計數方法包括平皿法和薄膜過(guò)濾法。檢查時(shí)，按已驗證的計數方法進(jìn)行供試品的細菌、霉菌及酵母菌菌數的測定。
按計數方法的驗證試驗確認的程序進(jìn)行供試液制備。用稀釋液稀釋成1 : 10 、1:l02 、l:103 等稀釋級的供試液。
1 ．平皿法
根據菌數報告規則取相應稀釋級的供試液lml ，置直徑90mm 的無(wú)菌平皿中，注人15 ～ 20ml 溫度不超過(guò)45 ℃ 的溶化的營(yíng)養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基，混勻，凝固，倒置培養。每稀釋級每種培養基至少制備2 個(gè)平板。
陰性對照試驗
取試驗用的稀釋液lml ，置無(wú)菌平皿中．注入培養基，凝固，倒置培養。每種計數用的培養基各制備2 個(gè)平板，均不得有菌生長(cháng)。
培養和計數
除另有規定外，細菌培養3 天，霉菌、酵母菌培養5 天，逐日觀(guān)察菌落生長(cháng)情況，點(diǎn)計菌落數，必要時(shí)，可適當延長(cháng)培養時(shí)間至7 天進(jìn)行菌落計數并報告。菌落蔓延生長(cháng)成片的平板不宜計數。點(diǎn)計菌落數后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數，按菌數報告規則報告菌數。若同稀釋級兩個(gè)平板的菌落平均數不小于15 ．則兩個(gè)平板的菌落數不能相差l 倍或以上。
一般營(yíng)養瓊脂培養基用于細菌計數；玫瑰紅鈉瓊脂培養基用于霉菌及酵母菌計數；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基用于酵母菌計數。在特殊情況下．若營(yíng)養瓊脂培養基上長(cháng)有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養基上長(cháng)有細菌，則應分別點(diǎn)計霉菌和酵母菌、細菌菌落數。然后將營(yíng)養瓊脂培養基上的霉菌和酵母菌數或玫瑰紅鈉瓊脂培養基上的細菌數，與玫瑰紅鈉瓊脂培養基中的霉菌和酵母菌數或營(yíng)養瓊脂培養基中的細菌數進(jìn)行比較，以菌落數高的培養基中的菌數為計數結果。
含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養基測定霉菌數，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基測定酵母菌數，合并計數。
菌數報告規則
細菌、酵母菌宜選取平均菌落數小于300CFU 、霉菌宜選取平均菌落數小于100CFU 的稀釋級，作為菌數報告（取兩位有效數字）的依據。以最高的平均菌落數乘以稀釋倍數的值報告1g、lml 或10cm2供試品中所含的菌數。
如各稀釋級的平板均無(wú)菌落生長(cháng)，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長(cháng)，但平均菌落數小于1 時(shí)，以＜1 乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。
2 ．薄膜過(guò)濾法
采用薄膜過(guò)濾法，濾膜孔徑應不大于0.45μm ，直徑一般為50mm ，若采用其他直徑的濾膜．沖洗量應進(jìn)行相應的調整。選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤濕濾膜。油類(lèi)供試品，其濾膜和濾器在使用前應充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過(guò)濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml �？倹_洗量不得超過(guò)1000ml.， 以避免濾膜上的微生物受損傷。
取相當于每張濾膜含lg 、lml或10cm2供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過(guò)濾。若供試品每1g 、lml 或10 cm2所含的菌數較多時(shí)，可取適宜稀釋級的供試液lml 進(jìn)行試驗。用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“計數方法的驗證”。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基平板上培養。每種培養基至少制備一張濾膜。
陰性對照試驗
取試驗用的稀釋液lml，照上述薄膜過(guò)濾法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長(cháng)。
培養和計數
培養條件和計數方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數應不超過(guò)100CFU 。
菌數報告規則
以相當于1g 、lml或10cm2 供試品的菌落數報告菌數；若濾膜上無(wú)菌落生長(cháng)，以＜1 報告菌數（每張濾膜過(guò)濾1g、lml 或10cm2 供試品），或＜l 乘以稀釋倍數的值報告菌數。
控制菌檢查
控制菌檢查用培養基的適用性檢查
控制菌檢查用的培養基應進(jìn)行培養基的適用性檢查，成品培養基、由脫水培養基或按處方配制的培養基均應檢查。
菌種
對試驗菌種的要求同計數培養基的適用性檢查。
大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC ( B ) 44l02]
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[ CMCC ( B ) 26003 ]
乙型副傷寒沙門(mén)菌（Salmonella paratyphi B ) 〔 CMCC ( B ) 50094 〕
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ）〔 CMCC ( B ) 10104 〕
生孢梭菌（Clostridium sporogenes ) [ CMCC ( B ) 6494l]
白色念珠菌（Candida albicans ）〔 CMCC ( F ) 98001 〕
菌液制備
接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門(mén)菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至營(yíng)養肉湯培養基中或營(yíng)養瓊脂培養基上，生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，培養18 ～24 小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，培養24 ～48 小時(shí)。用0.9 ％無(wú)菌氯化鈉溶液制成每lml 含菌數為10 ～100CFU 的菌懸液。
菌懸液在室溫下放置應在2 小時(shí)內使用．若保存在2～8 ℃ 可在24 小時(shí)內使用。
適用性檢查
控制菌檢查用培養基的適用性檢查項目包括促生長(cháng)能力、抑制能力及指示能力的檢查。各培養基的檢測項目及所用菌株見(jiàn)表2。
表2 控制菌檢查用培養基的促生長(cháng)能力、抑制能力及指示能力檢查
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控制菌檢查 |
培養基 |
特性 |
試驗菌株 |
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大腸埃希菌 |
膽鹽乳糖培養基 |
促生長(cháng)能力 |
大腸埃希菌 |
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抑制能力 |
金黃色葡萄球菌 |
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4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基 |
促生長(cháng)能力+指示能力 |
大腸埃希菌 |
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曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基 |
促生長(cháng)能力+指示能力 |
大腸埃希菌 |
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大腸菌群 |
乳糖膽鹽發(fā)酵培養基 |
促生長(cháng)能力 |
大腸埃希菌 |
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抑制能力 |
金黃色葡萄球菌 |
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乳糖發(fā)酵培養基 |
促生長(cháng)能力+指示能力 |
大腸埃希菌 |
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曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基 |
促生長(cháng)能力+指示能力 |
大腸埃希菌 |
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沙門(mén)菌 |
營(yíng)養肉湯培養基 |
促生長(cháng)能力 |
乙型副傷寒沙門(mén)菌 |
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四硫磺酸鈉亮綠培養基 |
促生長(cháng)能力 |
乙型副傷寒沙門(mén)菌 |
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抑制能力 |
金黃色葡萄球菌 |
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膽鹽硫乳瓊脂培養基或沙門(mén)、志賀菌屬瓊脂培養基 |
促生長(cháng)能力+指示能力 |
乙型副傷寒沙門(mén)菌 |
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曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基 |
促生長(cháng)能力+指示能力 |
乙型副傷寒沙門(mén)菌 |
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三糖鐵瓊脂培養基 |
指示能力 |
乙型副傷寒沙門(mén)菌 |
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銅綠假單胞菌 |
膽鹽乳糖培養基 |
促生長(cháng)能力 |
銅綠假單胞菌 |
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抑制能力 |
金黃色葡萄球菌 |
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溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基 |
促生長(cháng)能力 |
銅綠假單胞菌 |
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抑制能力 |
大腸埃希菌 |
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綠膿菌素測定用培養基 |
促生長(cháng)能力+指示能力 |
銅綠假單胞菌 |
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金黃色葡萄球菌 |
亞碲酸鹽肉湯培養基 |
促生長(cháng)能力 |
金黃色葡萄球菌 |
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抑制能力 |
大腸埃希菌 |
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卵黃氯化鈉瓊脂培養基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養基 |
促生長(cháng)能力 |
金黃色葡萄球菌 |
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抑制能力 |
大腸埃希菌 |
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梭菌 |
梭菌增菌培養基 |
促生長(cháng)能力 |
生孢梭菌 |
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哥倫比亞瓊脂培養基 |
促生長(cháng)能力 |
生孢梭菌 |
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白色念珠菌 |
沙氏葡萄糖液體培養基 |
促生長(cháng)能力 |
白色念珠菌 |
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沙氏葡萄糖瓊脂培養基 |
促生長(cháng)能力+指示能力 |
白色念珠菌 |
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念珠菌顯色培養基 |
促生長(cháng)能力+指示能力 |
白色念珠菌 |
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抑制能力 |
大腸埃希菌 |
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1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基 |
促生長(cháng)能力+指示能力 |
白色念珠菌 |
液體培養基促生長(cháng)能力檢查
分別接種不大于100CFU 的試驗菌（表2） 于被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時(shí)間下培養。與對照培養基管比較，被檢培養基管試驗菌應生長(cháng)良好。
固體培養墓促生長(cháng)能力檢查
取試驗菌各0.1ml （含菌數50～100CFU ）分別涂布于被檢培養基和對照培養基平板上，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時(shí)間下培養。被檢培養基與對照培養基上生長(cháng)的菌落大小、形態(tài)特征應一致。
培養基抑制能力檢查
接種不少于100CFU 的試驗菌（表2 ）于被檢培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最長(cháng)時(shí)間下培養，試驗菌應不得生長(cháng)。
固體培養基指示能力檢查
取試驗菌各0.1ml （含菌數不大于100CFU ) （表2 ）分別涂布于被檢培養基和對照培養基平板上，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及時(shí)間下培養。被檢培養基上試驗菌生長(cháng)的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應情況等應與對照培養基一致。
液體培養基指示能力檢查
分別接種不大于100CFU 的試驗菌（表2 ）于被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時(shí)間下培養。與對照培養基管比較，被檢培養基管試驗菌生長(cháng)情況、指示劑反應等應與對照培養基一致。
控制菌檢查方法的驗證
當建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時(shí)，應進(jìn)行控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該產(chǎn)品的控制菌檢查。若產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結果時(shí)，檢查方法應重新驗證。
驗證時(shí)，依各品種項下微生物限度標準中規定檢查的控制菌選擇相應驗證的菌株，驗證大腸菌群檢查法時(shí)，采用大腸埃希菌作為驗證菌株。驗證試驗按供試液的制備和控制菌檢查法的規定及下列要求進(jìn)行。
菌種及菌液制備
同控制菌檢查用培養基的適用性檢查。
驗證方法
取規定量供試液及10 ～100CFU 試驗菌加入增菌培養基中，依相應控制菌檢查法進(jìn)行檢查。當采用薄膜過(guò)濾法時(shí)．取規定量供試液，過(guò)濾，沖洗，試驗菌應加在最后一次沖洗液中，過(guò)濾后，注入增菌培養荃或取出濾膜接人增菌培養基中。
結果判斷
若上述試驗檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；若未檢出試驗菌，應采用培養基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗證。
驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行。
供試品檢查
供試品的控制菌檢查應按已驗證的方法進(jìn)行。
陽(yáng)性對照試驗
陽(yáng)性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查，對照菌的加菌量為10～10OCFU 。陽(yáng)性對照試驗應檢出相應的控制菌。
陰性對照試驗
取稀釋液10ml 照相應控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應無(wú)菌生長(cháng)，
（1）大腸埃希菌（Escherichia coli ） 取供試液10ml （相當于供試品lg 、lml 、10cm2 ) ，直接或處理后接種至適量（不少于100ml ）的膽鹽乳糖培養基中，培養18～ 24 小時(shí)，必要時(shí)可延長(cháng)至48 小時(shí)。
取上述培養物0.2ml ，接種至含5ml MUG 培養基的試管內，培養，于5 小時(shí)、24 小時(shí)在366nm 紫外光下觀(guān)察，同時(shí)用未接種的MUG 培養基作本底對照。若管內培養物呈現熒光，為MUG 陽(yáng)性；不呈現熒光，為MUG 陰性。觀(guān)察后，沿培養管的管壁加人數滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽(yáng)性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對照應為MUG 陰性和靛基質(zhì)陰性。
如MUG 陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG 陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG 陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性，或MUG 陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，則應取膽鹽乳糖培養基的培養物劃線(xiàn)接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基的平板上，培養18～24 小時(shí)。
若平板上無(wú)菌落生長(cháng)或生長(cháng)的菌落與表3 所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長(cháng)的菌落與表3 所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗，確認是否為大腸埃希菌。
表3 大腸埃希菌菌落形態(tài)特征
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培養基 |
菌落形態(tài) |
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曙紅亞甲藍瓊脂 |
紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無(wú)明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤 |
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麥康凱瓊脂 |
鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤 |
（2）大腸菌群（Coliform ） 取含適量（不少于10ml ) 的乳糖膽鹽發(fā)酵培養基管3 支，分別加入1 :10 的供試液lml（含供試品0.1g或0.1ml）、1: 100 的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）、1:1000的供試液1 ml（含供試品0.001g或0.001ml），另取1 支乳糖膽鹽發(fā)酵培養基管加人稀釋液1ml作為陰性對照管。培養18～24 小時(shí)。
乳糖膽鹽發(fā)酵管若無(wú)菌生長(cháng)或有菌生長(cháng)但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該管未檢出大腸菌群；若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應將發(fā)酵管中的培養物分別劃線(xiàn)接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養墓的平板上，培養18～24 小時(shí)。
若平板上無(wú)菌落生長(cháng)，或生長(cháng)的菌落與表4 所列的菌落形態(tài)特征不符或為非革蘭氏陰性無(wú)芽抱桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長(cháng)的菌落與表4 所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，且為革蘭氏陰性無(wú)芽抱桿菌，應進(jìn)行確證試驗。
表4 大腸菌群菌落形態(tài)特征
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培養基 |
菌落形態(tài) |
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曙紅亞甲藍瓊脂 |
紫黑色、紫紅色、紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊．表面光滑，濕潤 |
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麥康凱瓊脂 |
鮮桃紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤 |
確證試驗 從上述分離平板上挑選4 ～ 5 個(gè)疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養24 ～ 48 小時(shí)。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該乳糖膽鹽發(fā)醉管檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。
根據大腸菌群的檢出管數，按表5 報告lg 或lml 供試品中的大腸菌群數。
表5 可能的大腸菌群數
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各供試品量的檢出結果 |
可能的大腸菌群數N （個(gè)／g 或ml ) |
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0.1g或0.1ml |
0.01g或0.01ml |
0.01g或0.01ml |
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＋ |
＋ |
＋ |
> 103 |
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＋ |
＋ |
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102 < N < 103 |
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＋ |
― |
― |
10 < N < 102 |
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― |
― |
― |
< 10 |
注：＋代表檢出大腸菌群；―代表未檢出大腸菌群．
（3）沙門(mén)菌（salmonella ） 取供試品10g或10ml , 直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營(yíng)養肉湯培養基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，培養18～24 小時(shí)。
取上述培養物1ml ，接種于10 ml四硫磺酸鈉亮綠培養基中，培養18 ～24 小時(shí)后，分別劃線(xiàn)接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門(mén)、志賀菌屬瓊脂）培養基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍瓊脂）培養基的平板上，培養18 ～24 小時(shí)（必要時(shí)延長(cháng)至40～ 48 小時(shí)）。若平板上無(wú)菌落生長(cháng)或生長(cháng)的菌落不同于表6 所列的特征，判供試品未檢出沙門(mén)菌。
若平板上生長(cháng)的菌落與表6 所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接種針挑選2 ～3 個(gè)菌落分別于三糖鐵瓊脂培養基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養18 ～24 小時(shí)，如斜面未見(jiàn)紅色、底層未見(jiàn)黃色；或斜面黃色、底層無(wú)黑色，判供試品未檢出沙門(mén)菌。否則，應取三糖鐵瓊脂培養基斜面的培養物進(jìn)行適宜的鑒定試驗，確認是否為沙門(mén)菌。
表6沙門(mén)菌菌落形態(tài)特征
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培養基 |
菌落形態(tài) |
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膽鹽硫乳瓊脂 |
無(wú)色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無(wú)黑色 |
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沙門(mén)、志賀菌屬瓊脂 |
無(wú)色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)帶黑褐色 |
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曙紅亞甲藍瓊脂 |
無(wú)色至淺橙色．透明或半透明，光滑濕潤的圓形菌落 |
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麥康凱瓊脂 |
無(wú)色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時(shí)為暗色 |
（4）銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ） 取供試液10ml （相當于供試品1g 、lml 、10cm2 ) ，直接或處理后接種至適量（不少于100ml ）的膽鹽乳糖培養基中，培養18 ～24 小時(shí)。取上述培養物，劃線(xiàn)接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基的平板上，培養18～24 小時(shí)。
銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無(wú)定形、周邊擴散、表面濕潤，灰白色，周?chē)鷷r(shí)有藍綠色素擴散。如平板上無(wú)菌落生長(cháng)或生長(cháng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。如平板生長(cháng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應挑選2 ～3 個(gè)菌落，分別接種于營(yíng)養瓊脂培養基斜面上，培養18～ 24 小時(shí)。取斜面培養物進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢及氧化酶試驗。
氧化酶試驗
取潔凈濾紙片置于平皿內，用無(wú)菌玻棒取斜面培養物涂于濾紙片上，滴加新配制的1％二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30 秒內若培養物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽(yáng)性，否則為陰性。
若斜面培養物為非革蘭氏陰性無(wú)芽抱桿菌或氧化酶試驗陰性，均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則，應進(jìn)行綠膿菌素試驗。
綠膿菌素（Pyocyanin ）試驗
取斜面培養物接種于PDP 瓊脂培養基斜面上，培養24 小時(shí)，加三氯甲烷3 ～5ml至培養管中，攪碎培養基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加人lmol / L 鹽酸試液約lml ，振搖后，靜置片刻，觀(guān)察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗陽(yáng)性，否則為陰性。同時(shí)用未接種的PDP 瓊脂培養基斜面同法作陰性對照，陰性對照試驗應呈陰性。
若上述疑似菌為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶試驗陽(yáng)性及綠膿菌素試驗陽(yáng)性，判供試品槍出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽(yáng)性及綠膿菌素試驗陰性，應繼續進(jìn)行適宜的鑒定試驗，確認是否為銅綠假單胞菌。
( 5 )金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）取供試液l0ml （相當于供試品1g、lml 、l0cm2 ) ，直接或處理后接種至適見(jiàn)（不少于100ml）的亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營(yíng)養肉湯）培養基中，培養18 ～24 小時(shí)，必要時(shí)可延長(cháng)至48 小時(shí)。取上述培養物，劃線(xiàn)接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養基的平板上，培養24 ～72 小時(shí)。若平板上無(wú)菌落生長(cháng)或生長(cháng)的菌落不同于表7 所列特征，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。
表7金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)特征
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培養基 |
菌落形態(tài) |
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甘露醇氯化鈉瓊脂 |
金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)，菌落直徑0.7～lmm |
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卵黃氯化鈉瓊脂 |
金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑1 ～2mm |
若平板上生長(cháng)的菌落與表7 所列的菌落特征相符或疑似，應挑選2 ～3 個(gè)菌落，分別接種于營(yíng)養瓊脂培養基斜面上，培養18～24 小時(shí)。取營(yíng)養瓊脂培養基的培養物進(jìn)行革蘭氏染色．并接種于營(yíng)養肉湯培養基中，培養18～24 小時(shí)，做血漿凝固酶試驗。
血漿凝固酶試驗
取滅菌小試管3 支，各加入血漿和無(wú)菌水混合液（1 : 1 ) 0.5ml ，再分別加入可疑菌株的營(yíng)養肉湯培養物（或由營(yíng)養瓊脂培養基斜面培養物制備的濃菌懸液）0.5ml 、金黃色葡萄球菌營(yíng)養肉湯培養物（或由營(yíng)養瓊脂培養基斜面培養物制備的濃菌懸液）0.5ml 、營(yíng)養肉湯或0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液0.5ml , 即為試驗管、陽(yáng)性對照管和陰性對照管。將3 管同時(shí)培養，3 小時(shí)后開(kāi)始觀(guān)察直至24 小時(shí)。陰性對照管的血漿應流動(dòng)自如，陽(yáng)性對照管血漿應凝固，若試驗管血漿凝固為血漿凝固酶試驗陽(yáng)性，否則為陰性。如陽(yáng)性對照管或陰性對照管不符合規定時(shí)，應另制備血漿，重新試驗。
若上述疑似菌為非革蘭氏陽(yáng)性球菌、血漿凝固酶試驗陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。
( 6 )梭菌（Clostridium ） 取供試液10ml （相當于供試品1g 、lml 、10cm2 ) 2 份，其中l 份置80 ℃ 保溫10 分鐘后迅速冷卻。上述2 份供試液直接或處理后分別接種至100ml 的梭菌增菌培養基中。置厭氧條件下培養48 小時(shí)。取上述每一培養物0.2ml ，分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養基平板上，置厭氧條件下培養48～72 小時(shí)。若平板上無(wú)菌落生長(cháng)，判供試品未檢出梭菌；若平板上有菌落生長(cháng)，應挑選2 ～3 個(gè)菌落分別進(jìn)行革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶試驗。
過(guò)氧化氫酶試驗
取七述平板上的菌落，置潔凈玻片上，滴加3 ％過(guò)氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產(chǎn)生，為過(guò)氧化氫酶試驗陽(yáng)性，否則為陰性。
若上述可疑菌落為革蘭氏陽(yáng)性梭菌，有或無(wú)卵圓形或球形的芽孢，過(guò)氧化氫酶試驗陰性，判供試品檢出梭菌，否則判供試品未檢出梭菌。
( 7 )白色念珠菌（Candida albicans） 取供試液10ml （相當于供試品1g 、lml 、l0cm2）直接或處理后接種至適量（不少于10Oml）的沙氏葡萄糖液體培養基中，培養48 ～72 小時(shí)。取上述培養物劃線(xiàn)接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上，培養24 ～48 小時(shí)（必要時(shí)延長(cháng)至72 小時(shí)）。
白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長(cháng)的菌落呈乳白色，偶見(jiàn)淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養時(shí)間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺褶。若平板上無(wú)菌落生長(cháng)或生長(cháng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。如平板上生長(cháng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應挑選2 ～ 3 個(gè)菌落分別接種至念珠菌顯色培養基平板上 ，培養24～48 小時(shí)（必要時(shí)延長(cháng)至72 小時(shí)）。若平板上無(wú)綠色或翠綠色的菌落生長(cháng)，判供試品未檢出白色念珠菌。
若平板上生長(cháng)的菌落為綠色或翠綠色．挑取相符或疑似的菌落接種于1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基上．培養24～48 小時(shí)。取培養物進(jìn)行染色、鏡檢及芽管試驗。
芽管試驗
挑取l％聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基上的培養物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內，于35～ 37 ℃ 培養1 ～3 小時(shí)，置顯微鏡下觀(guān)察孢子上有否長(cháng)出短小芽管。
若上述疑似菌為非革蘭氏陽(yáng)性菌，顯微鏡下未見(jiàn)厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。
結果判斷
供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按一次檢出結果為準，不再復試。
供試品的細菌數、霉菌和酵母菌數其中任何一項不符合該品種項下的規定，應從同一批樣品中隨機抽樣，獨立復試兩次，以3 次結果的平均值報告菌數。
若供試品的細菌數、霉菌和酵母菌數及控制菌三項檢驗結果均符合該品種項下的規定，判供試品符合規定；若其中任何一項不符合該品種項下的規定．判供試品不符合規定。
稀釋液
稀釋液配制后，應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。
1 .pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液
照無(wú)菌檢查法（附錄XII A ）制備。
2.pH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無(wú)菌磷酸鹽緩沖液
按緩沖液（二部附錄XV D ）配制后，過(guò)濾，分裝，滅菌。
如需要，可在上述稀釋液滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。
3.0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液
取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml ，過(guò)濾，分裝，滅菌。
培養基及其制備方法
培養基可按以下處方制備，也可使用按該處方生產(chǎn)的符合要求的脫水培養基。配制后，應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。
1.營(yíng)養瓊脂培養基、營(yíng)養肉湯培養基、硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基及改良馬丁瓊脂培養基
照無(wú)菌檢查法（附錄XII A ）制備。
2.玫瑰紅鈉瓊脂培養基
胨 5.0g
玫瑰紅鈉 0.0133g
葡萄糖 10.0g
瓊脂 14.0g
磷酸二氫鉀 1.0g
水 1000ml
硫酸鎂 0.5g
除葡萄糖、玫瑰紅鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過(guò)，加入葡萄糖、玫瑰紅鈉，分裝．滅菌。
3.酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基（YPD )
胨 10.0g
瓊脂 14.0g
酵母浸出粉 5.0g
水 1000ml
葡萄糖 20.0g
除葡萄糖外，取上述成分．混合，微溫溶解，濾過(guò)，加人葡萄糖，分裝．滅菌。
4 ．膽鹽乳糖培養基(BL )
胨 20.0g
磷酸二氫鉀 1.3g
乳糖 5.0g
牛膽鹽 2.0g
氯化鈉 5.0g
（或去氧膽酸鈉） ( 0.5g)
磷酸氫二鉀 4.0g
水 1000ml
除乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.4 ±0.2 ，煮沸，濾清，加人乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉，分裝，滅菌。
5.乳糖膽鹽發(fā)酵培養基
胨 20.0g
0.04 ％溴甲酚紫指示液 25ml
乳糖 10.0g
水 l000ml
牛膽鹽 5.0g
除0.04 ％溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.4 ±0.2 ，加人0.04 ％溴甲酚紫指示液，根據要求的用量分裝于含倒管的試管中。滅菌。所用倒管的規格應保證產(chǎn)氣結果的觀(guān)察。
6．曙紅亞甲藍瓊脂培養基（EMB )
營(yíng)養瓊脂培養基 100ml
曙紅鈉指示液 2ml
20 ％乳糖溶液 5ml
亞甲藍指示液 1.3～1.6ml
取營(yíng)養瓊脂培養基，加熱溶化后，冷至60℃ ，按無(wú)菌操作加入滅菌的其他3 種溶液，搖勻，傾注平皿。
7.麥康凱瓊脂培養基（ MacC）
胨 20.0g
1 ％中性紅指示液 3ml
乳糖 10.0g
瓊脂 14.0g
牛膽鹽 5.0g
水 l000ml
氯化鈉 5.0g
除乳糖、1 ％中性紅指示液、牛膽鹽及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.2 ±0.2 ，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，冷至約60℃ ，傾注平皿。
8. 4 -甲基傘形酮葡糖昔酸（4-methylumbelliferyl-β-D-glucuionide，MUG）培養基
胨 10.0g
磷酸二氫鉀（無(wú)水） 0.9g
硫酸錳 0.5mg
磷酸氫二鈉（無(wú)水） 6.2g
硫酸鋅 0.5mg
亞硫酸鈉 40mg
硫酸鎂 0.1g
去氧膽酸鈉 1.0g
氯化鈉 5.0g
MUG 75mg
氯化鈣 50mg
水 l000ml
除MUG 外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.3±0.1，加人MUG ，溶解，每管分裝5ml ，滅菌。
9.三糖鐵瓊脂培養基（TSI )
胨 20.0g
牛肉浸出粉 5.0g
乳糖 10.0g
蔗糖 10.0g
葡萄糖 1.0g
氯化鈉 5.0g
硫酸亞鐵 0.2g
硫代硫酸鈉 0.2g
0.2 ％酚磺酞指示液 12.5ml
瓊脂 12.0g
水 1000ml
除三種糖、0.2％酚磺酞指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.3±0.1, 加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，制成高底層（2 ～3cm ）短斜面。
10 ．四硫磺酸鈉亮綠培養基（TTB）
胨 5.0g
硫代硫酸鈉 30.0g
牛膽鹽 1.0g
水 l000ml
碳酸鈣 10.0g
取上述成分，混合，微溫溶解，滅菌。
臨用前，取上述培養基，每10ml 加入碘試液0.2ml 和亮綠試液0.lml ，混勻。
11.沙門(mén)、志賀菌屬瓊脂培養基（SS）
胨 5.0g
硫代硫酸鈉 8.5g
牛肉浸出粉 5.0g
中性紅指示液 2.5ml
乳糖 10.0g
亮綠試液 0.33ml
牛膽鹽 8.5g
瓊脂 16.0g
枸櫞酸鈉 8.5g
水 1000ml
枸櫞酸鐵銨 1.0g
除乳糖、中性紅指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.2±0.1,濾過(guò)，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，滅菌，冷至60℃ ，傾注平皿。
12 ．膽鹽硫乳瓊脂培養基（DHL )
胨 20.0g
枸櫞酸鈉 1.0g
牛肉浸出粉 3.0g
枸櫞酸鐵銨 1.0g
乳糖 10.0g
中性紅指示液 3ml
蔗糖 10.0g
瓊脂 16.0g
去氧膽酸鈉 1.0g
水 l000ml
硫代硫酸鈉 2.3g
除糖、指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.2±0.1,加入瓊脂，加熱溶化后，再加人其余成分，搖勻，冷至60 ℃ ，傾注平皿。
13.溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基
胨 10.0g
溴化十六烷基三甲銨 0.3g
牛肉浸出粉 3.0g
瓊脂 14.0g
氯化鈉 5.0g
水 l000ml
除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.5±0.1 ，加入瓊脂，加熱溶化后，分裝，滅菌，冷至60 ℃ ，傾注平皿。
14 ．亞碲酸鹽肉湯培養基
臨用前，取滅菌的營(yíng)養肉湯培養基，每100ml 中加人新配制的1 ％亞諦酸鈉（鉀）試液0.2ml ，混勻，即得。
15 ．卵黃氯化鈉瓊脂培養基
胨 6.0g
10 ％氯化鈉卵黃液 100ml
牛肉浸出粉 1.8g
瓊脂 14.0g
氯化鈉 30.0g
水 650ml
除10 %氯化鈉卵黃液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.6 土0 .1 ，滅菌，待冷至約60 ℃ ，以無(wú)菌操作加入10 ％氯化鈉卵黃液，充分振搖，傾注平皿。
10 ％氯化鈉卵黃液的制備 取新鮮雞蛋1 個(gè)，以無(wú)菌操作取出卵黃，放入10%無(wú)菌氯化鈉溶液100ml 中，充分振搖，即得。
16.甘露醇氯化鈉瓊脂培養基
胨 10.0g
酚磺酞指示液 2.5ml
牛肉浸出粉 1.0g
瓊脂 14.0g
甘露醇 10.0g
水 l000ml
氯化鈉 75.0g
除甘露醇、酚磺酞指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節州值使滅菌后為7.4 ±0.2 ，加入瓊脂，加熱溶化后，濾過(guò)，分裝，滅菌，冷至60 ℃ ，傾注平皿。
17 ．乳糖發(fā)酵培養基
胨 20.0g
乳糖 10.0g
0.04 ％溴甲酚紫指示液 25ml
水 l000ml
除0.04 ％溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.2±0.2 ，加入指示液，分裝于含倒管的小試管中，每管3ml ．滅菌。
18 ．綠膿菌素（Pyocyanin）測定用培養基（PDP瓊脂培養基）
胨 20.0g
甘油 l0ml
氯化鎂（無(wú)水） 1.4g
瓊脂 14.0g
硫酸鉀（無(wú)水） 10.0g
水 1000ml
取胨、氯化鎂、硫酸鉀和水混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.3±0.1，加入甘油及瓊脂，加熱溶化，混勻，分裝于試管，滅菌，置成斜面。
19.梭菌增菌培養基
牛肉浸出粉 10.0g
鹽酸半胱氨酸 0.5g
胨 10.0g
氯化鈉 5.0g
酵母浸出粉 3.0g
醋酸鈉 3.0g
可溶性淀粉 1.0g
瓊脂 0.5g
葡萄糖 5.0g
水 1000ml
取上述成分，混合，加熱煮沸使溶解，調節pH 值使滅菌后為6.8士0.2，加熱溶化，濾過(guò)，分裝，滅菌。
20.哥倫比亞瓊脂培養基
酪蛋白胰酶消化物 10.0g
肉胃酶消化物 5.0g
心胰酶消化物 3.0g
酵母浸出粉 5.0g
玉米淀粉 1.0g
氯化鈉 5.0g
瓊脂 15.0g
水 1000ml
除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值使滅菌后為7.3士0.2，加入瓊脂，加熱溶化，濾過(guò)，分裝，滅菌，冷至45 ～50 ℃ ，加人相當于20mg 慶大霉素的無(wú)菌硫酸慶大霉素，混勻，傾注平皿。
21 ．沙氏葡萄糖液體培養基
胨 10g
葡萄糖 40g
水 1000ml
除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過(guò)。加人葡萄糖，溶解，分裝，滅菌。
22 ．沙氏葡萄糖瓊脂培養基
胨 10g
水 1000ml
葡萄糖 40g
瓊脂 14g
除瓊脂和葡萄糖外，混合，微溫溶解，濾過(guò)。加入瓊脂和葡萄糖，溶解，分裝，滅菌。
23.念珠菌顯色培養基注
胨 10.2g
瓊脂 15g
氫罌素 0.5g
滅菌水 1000ml
色素 22.0g
除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH 值至6.3 士0.2 。濾過(guò)，加入瓊脂，加熱煮沸，不斷攪拌至瓊脂完全溶解，傾注平皿。
24.1％聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基
黃色玉米粉 40g
瓊脂 10～15g
聚山梨酯80 10ml
水 1000ml
取玉米粉、聚山梨酯80及蒸餾水500ml，混合，65℃ 加熱30分鐘，混勻，用紗布濾過(guò)，補足原水量。取瓊脂，水500ml，混合，加熱溶解。將以上兩種溶液混合，搖勻，分裝，滅菌。
微生物限度標準
非無(wú)菌藥品的微生物限度標準是基于藥品的給藥途徑及對患者健康潛在的危害而制訂的。藥品的生產(chǎn)、貯存、銷(xiāo)售過(guò)程中的檢驗，原料及輔料的檢驗，新藥標準制訂，進(jìn)口藥品標準復核，考察藥品質(zhì)量及仲裁等，除另有規定外，其微生物限度均以本標準為依據。
1.制劑通則、品種項下要求無(wú)菌的制劑及標示無(wú)菌的制劑 應符合無(wú)菌檢查法規定。
2.口服給藥制劑
細菌數 每1g不得過(guò)l000CFU 。每lml 不得過(guò)100CFU 。
霉菌和酵母菌數 每lg或lml 不得過(guò)100CFU 。
大腸埃希菌每1g 或lml不得檢出.
3 ．局部給藥制劑
3.1用于手術(shù)、燒傷及嚴重創(chuàng )傷的局部給藥制劑 應符合無(wú)菌檢查法規定。
3.2 耳、鼻及呼吸道吸入給藥制劑
細菌數 每1g、lml 或l0cm2 ，不得過(guò)100CPU 。
霉菌和酵母菌數 每1g、lml 或l0cm2 ，不得過(guò)10CPU 。
金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌 每1g、lml 或l0cm2不得檢出。
大腸埃希菌 鼻及呼吸道給藥的制劑，每1g、lml 或l0cm2，不得檢出。
3.3 陰道、尿道給藥制劑
細菌數 每1g、lml 或l0cm2，不得過(guò)100CFU 。
霉菌數和酵母菌數 每1g、lml 或l0cm2 應小于10CFU 。
金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌 每1g、lml 或l0cm2，不得檢出。
3 .4 直腸給藥制劑
細菌數 每1g不得過(guò)l000CFU。每lml 不得過(guò)100CFU 。
霉菌和酵母菌數 每1g 或lml 不得過(guò)100CFU 。
金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌 每lg 或lml 不得檢出。
3.5 其他局部給藥制劑
細菌數 每1g、lml 或l0cm2不得過(guò)100CFU 。
霉菌和酵母菌數 每1g、lml 或l0cm2不得過(guò)100CFU 。
金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌 每1g、lml 或l0cm2不得檢出。
4.含動(dòng)物組織（包括提取物）的口服給藥制劑 每10g 或10ml 還不得檢出沙門(mén)菌。
5.有兼用途徑的制劑 應符合各給藥途徑的標準。
6.霉變、長(cháng)螨者 以不合格論。
7.原料及輔料 參照相應制劑的微生物限度標準執行。
注本檢查法中白色念珠菌檢查所描述該菌在念珠菌顯色培養基上的菌落特征，是指該菌在法國科瑪嘉公司提供的科瑪嘉念珠菌顯色培養基上生長(cháng)的菌落特征。給出這一信息是為了方便本方法的使用者，并不表示對該公司產(chǎn)品的認可．若其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，那么也可使用其他等效的產(chǎn)品。
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