細菌內毒素檢查法

      鱟試劑靈敏度復核試驗   在本檢查法規定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，用EU / ml 表示。當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結果的改變時(shí)，應進(jìn)行鱟試劑靈敏度復核試驗。

      根據賞試劑靈敏度的標示值（λ），將細菌內毒素國家標準品或細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解，在旋渦棍合器上混勻15分鐘，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個(gè)濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30 秒鐘。取分裝有0.1ml 鱟試劑溶液的10mm×75mm 試管或復溶后的0.1ml/支規格的鱟試劑原安瓶18 支，其中16 管分別加入0.1ml 不同濃度的內毒素標準溶液，每一個(gè)內毒素濃度平行做4 管；另外2 管加人0.1ml 細菌內毒素檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放人37 ℃ 士1 ℃ 的恒溫器中，保溫60 分鐘±2 分鐘。

       將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉l80° ，若管內形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過(guò)程應避免受到振動(dòng)造成假陰性結果。

       當最大濃度2λ管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效．按下式計算反應終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（λ_c）。

λ_c＝antilg （∑X / 4 )

式中   X 為反應終點(diǎn)濃度的對數值（lg ）。反應終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結果的濃度。

       當λ_c在0.5λ～2λ(包括0.5λ～2λ)時(shí)，方可用于細菌內毒素檢查，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

      干擾試驗   按表1 制備溶液A 、B 、C 和D ，使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過(guò)最大有效稀釋倍數( MVD ）的溶液，按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。

注：A為供試品溶液；B為干擾試劑系列；C鱟試劑標示靈敏度的對照系列；D為陰性對照。

只有當溶液A 和陰性對照溶液D 的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C 的結果在鱟試劑靈敏度復核范圍內時(shí)，試驗方為有效。按下式計算系列溶液C 和B 的反應終點(diǎn)濃度的幾何平均值（E_s和E_t ) :

E_s= antilg （∑X_s / 4 )

E_t=antilg （∑X_t : / 4 )

式中X_s X_t分別為系列溶液C 和溶液B 的反應終點(diǎn)濃度的對數值（lg）。

      當E_s在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及E_t在0.5E_s～ 2 E_s （包括0.5E_s和 2 E_s）時(shí)，認為供試品在該濃度下無(wú)干擾作用。若供試品溶液在小于MVD 的稀釋倍數下對試驗有干擾，應將供試品溶液進(jìn)行不超過(guò)MVD 的進(jìn)一步稀釋?zhuān)�再重復干擾試驗。

       可通過(guò)對供試品進(jìn)行更大倍數的稀釋或通過(guò)其他適宜的方法（如過(guò)濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會(huì )使內毒素失去活性，要使用預先添加了標準內毒素再經(jīng)過(guò)處理的供試品溶液進(jìn)行干擾試驗。

       當進(jìn)行新藥的內毒素檢查試驗前，或無(wú)內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗。

       當鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗。

 

     ( l )凝膠限度試驗  按表2 制備溶液A 、B 、C 和D 。使用稀釋倍數為MVD 并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來(lái)制備溶液A 和B 。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。

 

 

注：A 為供試品溶液；B 為供試品陽(yáng)性對照；C 為陽(yáng)性對照；D 為陰性對照。

 

     結果判斷   保溫60 分鐘±2 分鐘后觀(guān)察結果。若陰性對照溶液D 的平行管均為陰性，供試品陽(yáng)性對照溶液B 的平行管均為陽(yáng)性，陽(yáng)性對照溶液C 的平行管均為陽(yáng)性，試驗有效。
     若溶液A 的兩個(gè)平行管均為陰性，判定供試品符合規定；若溶液A 的兩個(gè)平行管均為陽(yáng)性，判定供試品不符合規定。若溶液A 的兩個(gè)平行管中的一管為陽(yáng)性，另一管為陰性，需進(jìn)行復試。復試時(shí)，溶液A 需做4 支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規定；否則判定供試品不符合規定。
      （2）凝膠半定量試驗   本方法系通過(guò)確定反應終點(diǎn)濃度來(lái)量化供試品中內毒素的含量。按表3 制備溶液A 、B 、C 和D 。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。

      結果判斷   若陰性對照溶液D 的平行管均為陰性，供試品陽(yáng)性對照溶液B 的平行管均為陽(yáng)性，系列溶液C 的反應終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.5λ～2λ之間，試驗有效。

     系列溶液A 中每一系列平行管的終點(diǎn)稀釋倍數乘以λ，為每個(gè)系列的反應終點(diǎn)濃度，所有平行管反應終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內毒素濃度[按公式c_E=antilg（∑X / 2 ）] 。如果檢驗時(shí)采用的是供試品的稀釋液，則計算原始溶液內毒素濃度時(shí)要將結果乘以稀釋倍數。
     如試驗中供試品溶液的所有平行管均為陰性，應記為內毒素濃度小于λ（如果檢驗的是稀釋過(guò)的供試品，則記為小于λ乘以供試品進(jìn)行半定量試驗的初始稀釋倍數）。如果供試品溶液的所有平行管均為陽(yáng)性，應記為內毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數乘以λ。

      若內毒素濃度小于規定的限值，判定供試品符合規定。若內毒素濃度大于或等于規定的限值，判定供試品不符合規定。

 

注：A為不超過(guò)MVD并且通過(guò)干擾試驗的供試品溶液。從通過(guò)干擾試驗的稀釋倍數開(kāi)始用檢查用水稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀釋倍數不得超過(guò)MVD。

      B為2λ濃度標準內毒素的溶液A（供試品陽(yáng)性對照）。

      C為鱟試劑標示靈敏度的對照系列。

       D為陰性對照。

 

      光度測定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。

       濁度法系利用檢測鱟試劑與內毒素反應過(guò)程中的濁度變化而測定內毒素含量的方法。根據檢測原理，可分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。終點(diǎn)濁度法是依據反應混合物中的內毒素濃度和其在孵育終止時(shí)的濁度（吸光度或透光率）之間存在著(zhù)量化關(guān)系來(lái)測定內毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測反應混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度所需要的反應時(shí)間，或是檢測濁度增加速度的方法。

     顯色基質(zhì)法系利用檢測鱟試劑與內毒素反應過(guò)程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少而測定內毒素含量的方法。根據檢測原理，分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法。終點(diǎn)顯色法是依據反應混合物中內毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出的呈色團的量之間存在的量化關(guān)系來(lái)測定內毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測反應混合物的色度達到某一預先設定的吸光度所需要的反應時(shí)間，或檢測色度增長(cháng)速度的方法。

      光度測定試驗需在特定的儀器中進(jìn)行，溫度一般為37℃ ±1℃ 。

       供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時(shí)間等，參照所用儀器和試劑的有關(guān)說(shuō)明進(jìn)行。

       為保證濁度和顯色試驗的有效性，應預先進(jìn)行標準曲線(xiàn)的可靠性試驗以及供試品的干擾試驗。

       標準曲線(xiàn)的可靠性試驗   當使用新批號的鱟試劑或試驗條件有任何可能會(huì )影響檢驗結果的改變時(shí)，需進(jìn)行標準曲線(xiàn)的可靠性試驗。

       用標準內毒素制成溶液，制成至少3 個(gè)濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數不得大于10），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標示檢測限。每一稀釋步驟的混勻時(shí)間同凝膠法，每一濃度至少做3 支平行管。同時(shí)要求做2 支陰性對照。當陰性對照的反應時(shí)間大于標準曲線(xiàn)最低濃度的反應時(shí)間，將全部數據進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析。

       根據線(xiàn)性回歸分析，標準曲線(xiàn)的相關(guān)系數（r）的絕對值應大于或等于0.980 ，試驗方為有效。否則須重新試驗。

      干擾試驗   選擇標準曲線(xiàn)中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內毒素濃度（設為λm），作為供試品干擾試驗中添加的內毒素濃度。按表4 制備溶液A 、B 、C 和D 。

 

注：A 為稀釋倍數不超過(guò)MVD 的供試品溶液。

      B 為加人了標準曲線(xiàn)中點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的一個(gè)已知濃度內毒素的，且與溶液A 有相同稀釋倍數的供試品溶液。

      C 為如“標準曲線(xiàn)的可靠性試驗”項下描述的，用于制備標準曲線(xiàn)的標準內毒素溶液。

      D 為陰性對照。

     按所得線(xiàn)性回歸方程分別計算出供試品溶液和含標準內毒素的供試品溶液的內毒紊含量c_t和c_s，再按下式計算該試驗條件下的回收率（R ）。

R = (c_s-c_t ) ×100 %

     當內毒素的同收率在50 ％—200 ％之間，則認為在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。

     當內毒素的回收率不在指定的范圍內，須按“凝膠法干擾試驗”中的方法去除干擾因素，并重復干擾試驗來(lái)驗證處理的有效性。

      當鱟試劑、供試品的來(lái)源、處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗。

      檢查法   按“光度測定法的干擾試驗”中的操作步驟進(jìn)行檢測。

      使用系列溶液C 生成的標準曲線(xiàn)來(lái)計算溶液A 的每一個(gè)平行管的內毒素濃度。

      試驗必須符合以下三個(gè)條件方為有效：

     ( 1 ）系列溶液C 的結果要符合“標準曲線(xiàn)的可靠性試驗”中的要求；

     ( 2 ）用溶液B 中的內毒素濃度減去溶液A 中的內毒素濃度后，計算出的內毒素的回收率要在50 % ～200 ％的范圍內；

     ( 3 ）溶液D 的反應時(shí)間應大于標準曲線(xiàn)最低濃度的反應時(shí)間。

     結果判斷  若供試品溶液所有平行管的平均內毒素濃度乘以稀釋倍數后，小于規定的內毒素限值，判定供試品符合規定．若大于或等于規定的內毒素限值，判定供試品不符合規定。
注：本檢查法中，“管”的意思包括其他任何反應容器，如微孔板中的孔。