藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則

本指導原則是為所采用的試驗方法能否替代藥典規定的方法用于藥品微生物的檢驗提供指導。

隨著(zhù)微生物學(xué)的迅速發(fā)展，制藥領(lǐng)域不斷引入了一些新的微生物檢驗技術(shù)，大體可分為三類(lèi)：( l )基于微生物生長(cháng)信息的檢驗技術(shù)，如生物發(fā)光技術(shù)、電化學(xué)技術(shù)、比濁法等；( 2 )直接測定被測介質(zhì)中活微生物的檢驗技術(shù)，如固相細胞技術(shù)法、流式細胞計數法等；( 3 )基于微生物細胞所含有特定組成成分的分析技術(shù)，如脂肪酸測定技術(shù)、核酸擴增技術(shù)、基因指紋分析技術(shù)等。這些方法與傳統檢查方法比較，或簡(jiǎn)便快速，或具有實(shí)時(shí)或近實(shí)時(shí)監控的潛力，使生產(chǎn)早期采取糾正措施及監控和指導優(yōu)良生產(chǎn)成為可能，同時(shí)新技術(shù)的使用也促進(jìn)了生產(chǎn)成本降低及檢驗水平的提高。

      在控制藥品微生物質(zhì)量中，微生物實(shí)驗室出于各種原因如成本、生產(chǎn)量、快速簡(jiǎn)便及提高藥品質(zhì)量等需要而采用非藥典規定的檢驗方法（即替代方法）時(shí)，應進(jìn)行替代方法的驗證，確認其應川效果優(yōu)于或等同于藥典的方法。

      藥品微生物檢驗方法主要分兩種類(lèi)型：定性試驗和定量試驗。定性試驗就是測定樣品中是否存在活的微生物，如無(wú)菌檢查及控制菌檢查。定量試驗就是測定樣品中存在的微生物數量，如菌落計數試驗。

      由于生物試驗的特殊性，如微生物檢驗方法中的抽樣誤差、稀釋誤差、操作誤差、培養誤差和計數誤差都會(huì )對檢驗結果造成影響，因此，藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則（二部附錄XIX A ）不完全適宜于微生物替代方法的驗證。藥品微生物檢驗替代方法的驗證參數見(jiàn)表l 。

      注：＋表示需要驗證的參數；－表示不需要驗證的參數。

      盡管替代方法的驗證參數與藥品質(zhì)量標準分析方法驗證參數有相似之處，但是其具體的內容是依據微生物檢驗特點(diǎn)而設立的。替代方法驗證的實(shí)驗結果需進(jìn)行統計分析，當替代方法屬于定性檢驗時(shí)，一般采用．非參數的統計技術(shù)；當替代方法屬于定量檢驗時(shí)，需要采用參數統計技術(shù)。

      進(jìn)行微生物替代方法的驗證時(shí)，若替代方法只是針對藥典方法中的某一環(huán)節進(jìn)行技術(shù)修改，此時(shí)，需要驗證的對象僅是該項替代技術(shù)而不是整個(gè)檢驗方法。如無(wú)菌試驗若改為使用含培養基的過(guò)濾器，然后通過(guò)適宜的技術(shù)確認活的微生物存在，那么，驗證時(shí)僅需驗證所用的微生物回收系統而不是整個(gè)無(wú)菌試驗方法。

      在開(kāi)展替代方法對樣品檢驗的適用性驗證前，有必要對替代方法有一個(gè)全面的了解。首先，所選用的替代方法應具備必要的方法適用性證據，表明在不含樣品的情況下，替代方法在不同類(lèi)型的微生物檢驗中所具有的專(zhuān)屬性、精密度和檢測限等參數。這些證據或由替代方法的研發(fā)者提供，或由方法使用者完成。

      使用者在基本確認替代方法的適用性后，應采用樣品按表l 規定的參數逐一進(jìn)行驗證，以確認替代方法可否用于該樣品的檢驗。驗證至少使用2 個(gè)批號的樣品，每批樣品應平行進(jìn)行至少3 次獨立實(shí)驗。

      在開(kāi)展各參數驗證時(shí)，涉及的菌種除應包括微生物限度檢夜法（附錄XII G ）和無(wú)菌檢查法（附錄XII A）中培養基適用性檢查規定的菌株外，還應根據替代方法及樣品的特點(diǎn)增加相應的菌株。各菌種應分別進(jìn)行驗證。

     微生物定性檢驗的專(zhuān)屬性是指檢測樣品中可能存在的特定微生物種類(lèi)的能力。當替代方法以微生物生長(cháng)作為判斷微生物是否存在時(shí)，其專(zhuān)屬性驗證應確認所用培養基的促生長(cháng)試驗，還應考慮樣品的存在對檢驗結果的影響。當替代方法不是以微生物生長(cháng)作為判斷指標時(shí)，其專(zhuān)屬性驗證應確認檢測系統中的外來(lái)成分不得干擾試驗而影響結果，如確認樣品的存在不會(huì )對檢驗結果造成影響。采用替代方法進(jìn)行控制菌的檢驗，還應選擇與控制菌具有類(lèi)似特性的菌株作為驗證對象。

      微生物定性檢驗的檢測限是指在替代方法設定的檢驗條件下，樣品種能被檢出的微生物的最低數量。由于微生物所具有的特殊性質(zhì)，檢測限是指在稀釋或培養之前初始樣品所含有的微生物數量，而不是指檢驗過(guò)程中某一環(huán)節的供試液中所含有的微生物數量。例如，微生物限度檢查中規定不得檢出沙門(mén)菌，對檢測限而言，是指每10g樣品中能被檢出的沙門(mén)菌的最低數量。

       檢測限確定的方法是在樣品中接種較低濃度的試驗菌（每單位不超過(guò)5CFU)，然后分別采用藥典方法和替代方法對該試驗菌進(jìn)行檢驗，以檢出與否來(lái)比較兩種方法的差異。試驗菌的接種量須根據試驗而定，以接種后采用藥典方法50 ％的樣品可檢出該試驗菌為宜。檢測限驗證至少應重復進(jìn)行5 次。對于同一種試驗菌可采用卡方檢驗（χ²）來(lái)評價(jià)兩種方法的檢測限是否存在差異。

3.重現性

      微生物定性檢驗的重現性是指相同的樣品在正常的實(shí)驗條件（如實(shí)驗地點(diǎn)、實(shí)驗人員、儀器、試劑的批次等）發(fā)生變化時(shí)，所得檢驗結果的精密度。重現性可視為微生物檢驗方法在檢驗結果上抵抗操作和環(huán)境變化的能力。方法使用者應優(yōu)先測定該驗證參數。在樣品中接種一定數量的試驗菌（接種量應在檢測限以上），采用藥典方法和替代方法，分別由不同人員，在不同時(shí)間，使用不同的試劑（或儀器）進(jìn)行檢驗，采用卡方檢驗（χ²）來(lái)評價(jià)兩種方法的重現性是否存在差異。驗證過(guò)程中，應關(guān)注樣品的一致性。

4 ．耐用性

      微生物定性檢驗的耐用性是指當方法參數有小的刻意變化時(shí)，檢驗結果不受影響的能力，為方法正常使用時(shí)的可靠性提供依據。方法使用者應優(yōu)先測定該驗證參數。與藥典方法比較，若替代方法檢驗條件較為苛刻，則應在方法中加以說(shuō)明。替代方法與藥典方法的耐用性比較不是必須的，但應單獨對替代方法的耐用性進(jìn)行評價(jià)，以便使用者了解方法的關(guān)鍵操作點(diǎn)。

      微生物定量檢驗一般都涉及菌落計數。對計數結果進(jìn)行數據處理時(shí)通常需要使用統計的方法。由于菌落計數服從泊松分布，因此采用泊松分布的統計方法對計數結果進(jìn)行數據處理優(yōu)于采用正態(tài)分布的統計方法。檢驗者往往習慣采用正態(tài)分布的統計方法，因此也可以通過(guò)對數轉換或平方根加l 的方法將原始數據轉換為正態(tài)分布數據后再進(jìn)行統計分析。兩種統計方法都適用于微生物數據的統計分析。

      微生物定量檢驗的準確度是指替代方法的檢驗結果與藥典方法檢驗結果一致的程度。準確度的確認應在檢測的范圍內，通常用微生物的回收率（% ）來(lái)表示。

       檢測范圍內的準確度都應符合要求，準確度驗證的方法是：制備試驗菌的菌懸液，菌懸液的濃度應選擇為能夠準確計數的最高濃度，然后系列稀釋至較低濃度（如小于10CFU / ml ）。例如，菌落計數平皿法的替代方法，在制備高濃度菌懸液時(shí)，其濃度可以是10³CFU / ml , 并系列稀釋至10⁰CFU / ml ．每個(gè)試驗菌應至少選擇5 個(gè)菌濃度進(jìn)行準確度確認，替代方法的檢驗結果不得少于藥典方法檢驗結果的70 % ，也可以采用合適的統計學(xué)方法表明替代方法的回收率至少與藥典方法一致。當替代方法的回收率高于藥典方法時(shí)，有必要結合專(zhuān)屬性項下的有關(guān)內容對準確度進(jìn)行評價(jià)。

      微生物定量檢驗的梢密度是指在檢驗范圍內．對同一個(gè)均勻的樣品多次重復取樣測定，其檢驗結果的一致程度，通常采用標準偏差或相對標準偏差來(lái)表示，也可以采用其他適宜的方式。

      精密度驗證的方法是：制備試驗菌的菌懸液，菌懸液的濃度應選擇為能夠準確讀數的最高濃度，然后系列稀釋至較低濃度（如小于10CFU / ml ）。每個(gè)試驗菌選擇其中至少5 個(gè)濃度的菌懸液進(jìn)行檢驗。每一個(gè)濃度至少應進(jìn)行10 次重復檢驗，以便能夠采用統計分析方法得到標準偏差或相對標準偏差。一般倩況下，可以接受的相對標準偏差（RSD ）應不大于35 % 。不考慮特殊的檢驗結果，替代方法的相對標準偏差（RSD ）應不大于藥典方法。例如，藥典菌落計數平皿法其可接受的相對標準偏差( RSD )與含菌濃度的關(guān)系見(jiàn)表2 。

表2 不同含菌濃度下預期的相對標準偏差

      微生物定量檢驗的專(zhuān)屬性是指通過(guò)檢測適宜的試驗菌，以證明檢驗方法與其設定目的相適應的能力。例如，菌落計數平皿法其設定目的在于檢出一定數量的微生物，則其專(zhuān)屬性驗證應證明當樣品中存在一定數量的試驗菌時(shí)，通過(guò)平皿法檢驗，能夠檢出試驗菌，而樣品的存在不會(huì )對結果造成影響。專(zhuān)屬性驗證時(shí)，應能夠設計出可能使替代方法出現假陽(yáng)性的實(shí)驗模型來(lái)挑戰替代方法，從而確認替代方法的適用性。當替代方法不依賴(lài)微生物生長(cháng)出菌落或出現混濁就可以定量時(shí)（如不需要增菌或在l～50CFU 范圍內就可直接測定菌數的定量方法），以上驗證方式就顯得更為重要。

      微生物定量檢驗的定量限是指樣品中能被準確定量測定的微生物最低數量。由于無(wú)法得到含有已知微生物數量的實(shí)驗樣品，因此，在定量限驗證時(shí)，應選擇在檢驗范圍內至少5 個(gè)菌濃度．每個(gè)濃度重復取樣測定不少于5 次，替代方法的定量限不得大于藥典方法。需要注意的是，由于細菌計數和菌落數服從泊松分布，可能存在計數結果的誤差，因此替代方法的定量限僅需證實(shí)在相近的低限度下其靈敏度至少相當于藥典方法。

     定量限驗證的方法是：在檢驗范圍的低限制備5 份不同含菌濃度的菌懸液，每份菌懸液分別用藥典方法和替代方法進(jìn)行不少于5 次檢驗，采用統計方法比較替代方法的檢驗結果與藥典方法結果的差異．從而評價(jià)替代方法的定量限。

      微生物定量檢驗的線(xiàn)性是指在一定范圍內，檢驗結果與樣品中微生物數量成比例關(guān)系的程度。線(xiàn)性驗證時(shí)必須覆蓋能夠準確測定的所有濃度范圍。每株試驗菌應選擇至少5 個(gè)濃度．每個(gè)濃度至少測定5 次。根據以上實(shí)驗數據，以檢驗結果為因變量，以樣品中微生物的預期數量為自變量進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，計算相關(guān)系數r 。當相關(guān)系數不能準確評估線(xiàn)性時(shí)．只能確定簡(jiǎn)單大約的關(guān)系值。替代方法的相關(guān)系數不得低于0.95。

      微生物定址檢驗的范圍是指能夠達到一定的準確度、精密度和線(xiàn)性，檢驗方法適用的高低限濃度或數量的區間。

       微生物定量檢驗的重現性是指相同的樣品在正常的實(shí)驗條件（如實(shí)驗地．點(diǎn)、實(shí)驗人員、儀器、試劑的批次等）發(fā)生變化時(shí)，所得檢驗結果的精密度。重現性可視為微生物檢驗方法在檢驗結果上抵抗操作和環(huán)境變化的能力。方法使用者應優(yōu)先測定該驗證參數。在樣品中接種一定數址的試驗菌（接種量應在定量限以上），采用藥典方法和替代方法，分別由不同人員，在不同時(shí)間，使用不同的試劑（或儀器）進(jìn)行檢驗，對檢驗結果進(jìn)行統計分析，以相對標準偏差（RSD ）來(lái)評價(jià)兩種方法的重現性差異。驗證過(guò)程中，應關(guān)注樣品的一致性。

      微生物定量檢驗的耐用性是指當方法參數有小的刻意變化時(shí)，檢驗結果不受影響的能力，為方法正常使用時(shí)的可靠性提供依據。方法使用者應優(yōu)先測定該驗證參數。與藥典方法比較，若替代方法檢驗條件較為苛刻，則應在方法中加以說(shuō)明。替代方法與藥典方法的耐用性比較不是必須的，但應單獨對替代方法的耐用性進(jìn)行評價(jià)，以便使用者了解方法的關(guān)鍵操作點(diǎn)。附錄125