藥品微生物實(shí)驗室規范指導原則

     藥品微生物實(shí)驗室規范指導原則用于指導藥品微生物檢驗實(shí)驗室的質(zhì)量控制。

     藥品微生物的檢驗結果受很多因素的影響，如樣品中微生物可能分布不均勻、微生物檢驗方法的誤差較大等。因此，在藥品微生物檢驗中，為保證檢驗結果的可靠性，必須使用經(jīng)驗證的檢測方法并嚴格按照藥品微生物實(shí)驗室規范要求進(jìn)行試驗。

     藥品微生物實(shí)驗室規范包括以下幾個(gè)方面：人員、培養基、菌種、實(shí)驗室的布局和運行、設備、文件、實(shí)驗記錄、結果的判斷等。

      從事藥品微生物試驗工作的人員應具備微生物學(xué)或相近專(zhuān)業(yè)知識的教育背景。

      實(shí)驗人員應依據所在崗位和職責接受相應的培訓，在確認他們可以承擔某一試驗前，他們不能獨立從事該項微生物試驗。應保證所有人員在上崗前接受勝任工作所必需的設備操作、微生物檢驗技術(shù)和實(shí)驗室生物安全等方面的培訓，經(jīng)考核合格后方可上崗，同時(shí)，實(shí)驗室應制定所有級別實(shí)驗人員的繼續教育計劃。

     檢驗人員必須熟悉相關(guān)檢測方法、程序、檢測目的和結果評價(jià)。微生物實(shí)驗室的管理者其專(zhuān)業(yè)技能和經(jīng)驗水平應與他們的職責范圍相符，如：管理技能、實(shí)驗室安全、試驗安排、預算、實(shí)驗研究、實(shí)驗結果的評估和數據偏差的調查、技術(shù)報告書(shū)寫(xiě)等。

     實(shí)驗室應通過(guò)參加內部質(zhì)量控制、能力驗證或使用標準菌株等方法客觀(guān)評估檢驗人員的能力，必要時(shí)對其進(jìn)行再培訓并重新評估。當使用一種非經(jīng)常使用的方法或技術(shù)時(shí)，有必要在檢測前確認微生物檢測人員的操作技能。

      所有人員的培訓、考核內容和結果均應記錄歸檔。

      培養基是微生物試驗的基礎，直接影響微生物試驗結果。適宜的培養基制備方法、貯藏條件和質(zhì)量控制試驗是提供優(yōu)質(zhì)培養基的保證。

      培養基可按處方配制，也可使用按處方生產(chǎn)的符合規定的脫水培養基。

      在制備培養基時(shí)，應選擇質(zhì)量符合要求的脫水培養基或單獨配方組分進(jìn)行配制。脫水培養基應附有處方和使用說(shuō)明，配制時(shí)應按使用說(shuō)明上的要求操作以確保培養基的質(zhì)量符合要求，不得使用結塊或顏色發(fā)生改變的脫水培養基。脫水培養基或單獨配方組分應在適當的條件下貯藏，如低溫、干燥和避光，所有的容器應密封，尤其是盛放脫水培養基的容器。商品化的成品培養基除了應附有處方和使用說(shuō)明外，還應注明有效期、貯藏條件、適用性檢查試驗的質(zhì)控菌和用途。

      為保證培養基質(zhì)量的穩定可靠，各脫水培養基或各配方組分應準確稱(chēng)量，并要求有一定的精確度。配制培養基最常用的溶劑是純化水，特殊情況下，可能需要用去離子水和蒸餾水。應記錄各稱(chēng)量物的重量和水的使用量。

      配制培養基所用容器和配套器具應潔凈，可用純化水沖洗玻璃器皿以消除清潔劑和外來(lái)物質(zhì)的殘留，對熱敏感的培養基如糖發(fā)酵培養基其分裝容器一般應預先進(jìn)行滅菌，以保證培養基的無(wú)菌性。

      脫水培養基應完全溶解于水中，再行分裝與滅菌。配制時(shí)若需要加熱助溶，應注意不要過(guò)度加熱，以避免培養基顏色變深。如需要添加其他組分時(shí)，加入后應充分混勻。應按照生產(chǎn)商提供或使用者驗證的參數進(jìn)行培養基的滅菌。商品化的成品培養基必須附有所用滅菌方法的資料。培養基滅菌一般采用濕熱滅菌技術(shù)，特殊培養基可采用薄膜過(guò)濾除菌。

      培養基若采用不適當的加熱和滅菌條件，有可能引起顏色變化、透明度降低、瓊脂凝固力或pH 的改變。因此，培養基應采用驗證的滅菌程序滅菌，培養基滅菌方法和條件，應通過(guò)無(wú)菌性試驗和促生長(cháng)試驗進(jìn)行驗證。此外，對高壓滅菌器的蒸汽循環(huán)系統也要加以驗證，以保證在一定裝載方式下的正常熱分布。溫度緩慢上升的高壓滅菌器可能導致培養基的過(guò)熱，過(guò)度滅菌可能會(huì )破壞絕大多數的細菌和真菌培養基促生長(cháng)的質(zhì)量。滅菌器中培養基的容積和裝載方式也將影響加熱的速度。因此，應根據滅菌培養基的特性，進(jìn)行全面的滅菌程序驗證。

      應確定每批培養基滅菌后的pH值（冷卻至室溫25 ℃ 測定）。若培養基處方中未列出pH 值的范圍，除非經(jīng)驗證表明培養基的pH 值允許的變化范圍很寬，否則，pH值的范圍不能超過(guò)規定值士0.2 。

      制成平板或分裝于試管的培養基應進(jìn)行下列檢查：容器和蓋子不得破裂，裝量應相同，盡量避免形成氣泡，固體培養基表面不得產(chǎn)生裂縫或漣漪，在冷藏溫度下不得形成結晶，不得污染微生物等。應檢查和記錄批數量、有效期及培養基的無(wú)菌檢查。

自配的培養基應標記名稱(chēng)、批號、配制日期等信息，并在已驗證的條件下貯藏。商品化的成品培養基標簽上應標有名稱(chēng)、批號、生產(chǎn)日期、失效期及培養基的有關(guān)特性，生產(chǎn)商和使用者應根據培養基使用說(shuō)明書(shū)上的要求進(jìn)行貯藏，所采用的貯藏和運輸條件應使成品培養基最低限度的失去水分并提供機械保護。

      培養基滅菌后若貯藏在高壓滅菌器中，質(zhì)量可能會(huì )受影響，一般不提倡這種存放法。瓊脂培養基不得在O ℃ 或O ℃ 以下存放，因為冷凍可能破壞凝膠特性。培養基應避光保存，若要長(cháng)期保存，應置于密閉容器中以防止水分流失。瓊脂平板最好現配現用，如置冰箱保存，一般不超過(guò)1周，且應密閉包裝，若延長(cháng)保存期限，保存期需經(jīng)驗證確定。

      固體培養基滅菌后的再融化只允許1 次，以避免因過(guò)度受熱造成培養基質(zhì)量下降或微生物污染。培養基的再融化一般采用水浴或流通蒸汽加熱。若使用微波爐，應避免培養基過(guò)度受熱及水分的蒸發(fā)，更要注意安全。融化的培養基應置于45 ～50 ℃ 的水浴中，不得超過(guò)8 小時(shí)。傾注培養基時(shí)， 應擦干培養基容器外表面的水分，避免容器外壁的水滴進(jìn)人培養基中造成污染。

      使用過(guò)的培養基（包括失效的培養基）應按照國家污染廢物處理相關(guān)規定進(jìn)行。

      實(shí)驗室應對試驗用培養基建立質(zhì)量控制程序，以確保所用培養基質(zhì)量符合相關(guān)檢測的需要。

      實(shí)驗室配制或商品化的成品培養基的質(zhì)量依賴(lài)于其制備過(guò)程，采用不適宜方法制備的培養基將影響微生物的生長(cháng)或復蘇，從而影響試驗結果的可靠性。

      所有配制好的培養基均應進(jìn)行質(zhì)量控制試驗。實(shí)驗室配制的培養基的常規監控項目是pH 、適用性檢查試驗，定期的穩定性檢查以確定有效期。培養基在有效期內應依據適用性檢查試驗確定培養基質(zhì)量是否符合要求。有效期的長(cháng)短將取決于在一定存放條件下（包括容器特性及密封性）的培養基其組成成分的穩定性。

      除藥典附錄另有規定外，在實(shí)驗室中，若采用已驗證的配制和滅菌程序制備培養基且過(guò)程受控，那么同一批脫水培養基的適用性檢查試驗可只進(jìn)行1 次。如果培養基的制備過(guò)程未經(jīng)驗證，那么每一批培養基均要進(jìn)行適用性檢查試驗，試驗的菌種可根據培養基的用途從相關(guān)附錄中進(jìn)行選擇，也可增加從生產(chǎn)環(huán)境及產(chǎn)品中常見(jiàn)的污染菌株。

      培養基的質(zhì)屋控制試驗若不符合規定，應尋找不合格的原因，以防止問(wèn)題重復出現。任何不符合要求的培養基均不能使用。

      用于環(huán)境監控的培養基須特別防護，最好要雙層包裝和終端滅菌，如果不能采用終端滅菌的培養基，那么在使用前應進(jìn)行100 ％的預培養以防止外來(lái)的污染物帶到環(huán)境中及避免出現假陽(yáng)性結果。

      試驗過(guò)程中，生物樣本可能是最敏感的，因為它們的活性和特性依賴(lài)于合適的試驗操作和貯藏條件。實(shí)驗室菌種的處理和保藏的程序應標準化，使盡可能減少菌種污染和生長(cháng)特性的改變。按統一操作程序制備的菌株是微生物試驗結果一致性的重要保證。

      藥品微生物檢驗用的試驗菌應來(lái)自認可的國內或國外菌種保藏機構的標準菌株，或使用與標準菌株所有相關(guān)特性等效的商業(yè)派生菌株。

      標準菌株的復活或培養物的制備應按供應商提供的說(shuō)明或按已驗證的方法進(jìn)行。從國內或國外菌種保藏機構獲得的標準菌株經(jīng)過(guò)復活并在適宜的培養基中生長(cháng)后，即為標準儲備菌株。標準儲備菌株應進(jìn)行純度和特性確認。標準儲備菌株保存時(shí)，可將培養物等份懸浮于抗冷凍的培養基中，并分裝于小瓶中，建議采用低溫冷凍干燥、液氮貯存、超低溫冷凍（低于-30 ℃ ）等方法保存。低于-70 ℃ 或低溫冷凍干燥方法可以延長(cháng)菌種保存時(shí)間。標準儲備菌株可用于制備每月或每周1 次轉種的工作菌株。冷凍菌種一旦解凍轉種制備工作菌株后，不得重新冷凍和再次使用。

       工作菌株的傳代次數應嚴格控制，不得超過(guò)5 代（從菌種保藏機構獲得的標準菌株為第0代），以防止過(guò)度的傳代增加菌種變異的風(fēng)險。1 代是指將活的培養物接種到微生物生長(cháng)的新鮮培養基中培養，任何亞培養的形式均被認為是轉種或傳代1 次。必要時(shí)，實(shí)驗室應對工作菌株的特性和純度進(jìn)行確認。

       工作菌株不可替代標準菌株，標準菌株的商業(yè)衍生物僅可用作工作菌株。

       實(shí)驗室必須建立和保存其所有菌種的進(jìn)出、收集、貯藏、確認試驗以及銷(xiāo)毀的記錄，應有菌種管理的程序文件（從標準菌株到工作菌株），該程序包括：標準菌種的申購記錄；從標準菌株到工作菌株操作及記錄，菌種必須定期轉種傳代，并做純度、特性等實(shí)驗室所需關(guān)鍵指標的確認，并記錄；每支菌種都應注明其名稱(chēng)、標準號、接種日期、傳代數；菌種生長(cháng)的培養基和培養條件；菌種保藏的位置和條件；其他需要的程序。

      實(shí)驗室應具有進(jìn)行微生物檢測所需的適宜、充分的設施條件。實(shí)驗室的布局與設計應充分考慮到良好微生物實(shí)驗室操作規范和實(shí)驗室安全的要求。實(shí)驗室布局設計的基本原則是既要最大可能防止微生物的污染，又要防止檢驗過(guò)程對環(huán)境和人員造成危害�；顒�(dòng)區域的合理規劃及區分將提高微生物實(shí)驗室操作的可靠性。

      通常，實(shí)驗室應劃分成相應的潔凈區域和活菌操作區域，同時(shí)應根據試驗目的，在時(shí)間或空間上有效分隔不相容的試驗活動(dòng)，將交叉污染的風(fēng)險降低到最低。

      一般情況下，藥品微生物檢驗的實(shí)驗室應有符合無(wú)菌檢查法（附錄XI H ）和微生物限度檢查法（附錄XI J ）要求的、用于具有開(kāi)展無(wú)菌檢查、微生物限度檢查、無(wú)菌采樣等檢測活動(dòng)的、獨立設置的潔凈室（區）或隔離系統，并為上述檢驗配備相應的陽(yáng)性菌實(shí)驗室、培養室、試驗結果觀(guān)察區、培養基及實(shí)驗用具準備（包括滅菌）區、樣品接收和貯藏區、標準菌株貯藏區、污染物處理區和文檔處理區等輔助區域，同時(shí)，應對上述區域明確標識。

      實(shí)驗室應對進(jìn)出潔凈區域的人和物建立控制程序和標準操作規程，應按相關(guān)國家標準建立潔凈室（區）和隔離系統的驗證、使用和清潔維護標準操作規程，對可能影響檢測結果的工作（如潔凈度驗證及監測、消毒、清潔維護等）能夠有效地控制、監測并記錄。

       實(shí)驗室對所用的消毒劑種類(lèi)應定期更換，使用的消毒劑應無(wú)菌。

      若需要進(jìn)一步分析培養物的特性，如再培養、染色、微生物鑒定或其他確定試驗均應在實(shí)驗室的活菌操作區進(jìn)行。任何出現微生物生長(cháng)的培養物不得在實(shí)驗室無(wú)菌區域內打開(kāi)。對染菌的樣品及培養物應有效隔離以減少假陽(yáng)性結果的出現。

      不能在實(shí)驗室的活菌操作區域或鄰近區域進(jìn)行抽樣。采樣時(shí)，應采用無(wú)菌操作技術(shù)進(jìn)行取樣，防止在取樣過(guò)程中使樣品受到微生物的污染而導致假陽(yáng)性的結果。因此，實(shí)驗設施應設計成保證樣品在控制條件下抽樣，包括能有效防止微生物污染的無(wú)菌設施及環(huán)境、適宜的無(wú)菌服、無(wú)菌抽樣器具和合格的操作人員，并記錄抽樣環(huán)境的監測結果。如果可能，所有的樣品應在具有無(wú)菌條件的特定抽樣間進(jìn)行無(wú)菌抽樣。

      被檢樣品應有傳遞、貯藏、處置和識別管理程序。待驗樣品應在合適的條件下貯藏并能夠保證其完整性而不改變其性狀，應明確規定和記錄貯藏條件。

實(shí)驗室應有妥善處理廢棄樣品和有害廢棄物的設施和制度，還應針對類(lèi)似于帶菌培養物溢出的意外事件制定處理規程，如：活的培養物灑出必須就地處理，不得使培養物污染擴散。

      實(shí)驗室應配備與檢驗能力和工作量相適應的儀器設備，其類(lèi)型、測量范圍和準確度等級應滿(mǎn)足檢驗所采用標準的要求，設備的安裝和布局應便于操作，易于維護、清潔和校準。

      實(shí)驗室在儀器設備完成相應的檢定、校準、驗證、確認其性能，并形成相應的操作、維護和保養的標準操作規程后方可正式使用，使用要有記錄。為保證設備處于良好工作狀態(tài)，應定期維護和期間核查，并保存相關(guān)記錄。

      微生物實(shí)驗室所用的儀器應根據日常使用的情況進(jìn)行定期的校準，并記錄。校準的周期和校驗的內容根據儀器的類(lèi)型和設備在實(shí)驗室產(chǎn)生的數據的重要性的不同而不同。重要的儀器設備，如培養箱、冰箱等，應由專(zhuān)人負責，保證其運行狀態(tài)正常和受控，同時(shí)應有相應的備用設備以保證試驗菌株和微生物培養的連續性；對于培養箱、冰箱、高壓滅菌鍋等影響實(shí)驗準確性的關(guān)鍵設備應在其運行過(guò)程中對關(guān)鍵參數（如溫度、壓力）進(jìn)行連續觀(guān)測和記錄，有條件的情況下盡量使用自動(dòng)記錄裝置。如果發(fā)生偏差，應評估對以前的檢測結果造成的影響并采取必要的糾正措施。

      對于一些容易污染微生物的儀器設備如水浴鍋、培養箱、冰箱和生物安全柜等應定期進(jìn)行清潔和消毒。

      對試驗需用的無(wú)菌器具應實(shí)施正確的清洗、滅菌措施，并形成相應的標準操作規程，無(wú)菌器具應有明確標識并與非無(wú)菌器具加以區別。

      文件應當充分表明試驗是在實(shí)驗室里按可控的檢查法進(jìn)行的，一般包括以下方面：人員培訓與資格確認；設備驗收、驗證、檢定（或校準期間核查）和維修；設備使用中的運行狀態(tài)（設備的關(guān)鍵參數）；培養基制備、貯藏和質(zhì)量控制；檢驗規程中的關(guān)鍵步驟；數據記錄與結果計算的確認；質(zhì)量責任人對試驗報告的評估；數據偏離的調查。

     實(shí)驗結果的可靠性依賴(lài)于試驗嚴格按照標準操作規程進(jìn)行，而標準操作規程應指出如何進(jìn)行正確的試驗操作。實(shí)驗記錄應包含所有關(guān)鍵的實(shí)驗細節，以便確認數據的完整性。

      實(shí)驗室原始記錄至少應包括以下內容：實(shí)驗日期、檢品名稱(chēng)、實(shí)驗人員姓名、標準操作規程編號或方法、實(shí)驗結果、偏差（存在時(shí)）、實(shí)驗參數（所使用的設備、菌種、培養基和批號以及培養溫度等）、主管／復核人簽名。

      試驗所用的每一個(gè)關(guān)鍵的實(shí)驗設備均應記錄在案，任何恰當的日常記錄都是有用的。應設計合適的設備日志或表格，以滿(mǎn)足試驗記錄的追蹤性，設備溫度（水浴、培養箱、滅菌器）必須記錄，且具有追溯性。

      實(shí)驗記錄寫(xiě)錯時(shí)，用單線(xiàn)劃掉并簽字。原來(lái)的數據不能抹去或被覆蓋。

所有實(shí)驗室記錄應以文件形式保存并防止意外遺失，正規的記錄應存放在特定的地方并有登記。

      由于微生物試驗的特殊性，在實(shí)驗結果分析時(shí)，應從各個(gè)可能的方面去考慮，不但要假設被污染，而且要考慮微生物在原料、輔料或試驗環(huán)境中存活的可能性。此外，還應考慮微生物的生長(cháng)特性。

      對實(shí)驗結果應進(jìn)行充分和全面的評價(jià)。所有影響結果觀(guān)察的微生物條件和因素應完全考慮，包括與規定的限度或標準有很大偏差的結果。關(guān)鍵是應知道實(shí)驗結果與標準的差別是否有統計學(xué)意義。

若發(fā)現實(shí)驗結果不符合藥典各品種項下要求或另外建立的質(zhì)量標準，應進(jìn)行原因調查。引起微生物污染結果不符合標準的原因主要有兩個(gè)：試驗操作錯誤或產(chǎn)生無(wú)效結果的試驗環(huán)境條件；產(chǎn)品本身的微生物污染總數超過(guò)規定的限度或檢出控制菌。

       異常結果分析時(shí)，應考慮實(shí)驗室環(huán)境、抽樣區的防護條件、樣品在該檢驗條件下以往檢驗的情況、樣品本身具有使微生物存活或繁殖的特性等情況。此外，回顧試驗過(guò)程，也可評價(jià)該實(shí)驗結果的可靠性及實(shí)驗過(guò)程是否恰當。如果試驗操作被確認是引起實(shí)驗結果不符合的原因，那么應制定改錯方案以解決問(wèn)題，按照正確的操作方案進(jìn)行實(shí)驗，在這種情況下，對試驗過(guò)程及試驗操作應特別認真地進(jìn)行監控。

     如果依據分析調查結果發(fā)現試驗有錯誤而判實(shí)驗結果無(wú)效，那么這種情況必須記錄。實(shí)驗室也必須認可復試程序，如果需要，可按相關(guān)規定重新抽樣，但抽樣方法不能影響不符合規定結果的分析調查。