支原體檢查法

附錄XII B 支原體檢查法

主細胞庫、工作細胞庫、病毒種子批、對照細胞以及臨床治療用細胞進(jìn)行支原體檢查時(shí)，應同時(shí)進(jìn)行培養法和指示細胞法（DNA染色法）。病毒類(lèi)疫苗的病毒收獲液、原液采用培養法檢查支原體，必要時(shí)，亦可采用指示細胞法篩選培養基。也可采用經(jīng)國家藥品檢定機構認可的其他方法

第一法  培養法

推薦培養基及其處方

（1）支原體肉湯培養基

豬胃消化液  500ml

氯化鈉2.5g

牛肉浸液（1:2）500ml

葡萄糖  5.0g

酵母浸粉5.0g

酚紅0.02g

pH值7.6±0.2。于121℃滅菌15分鐘。

（2）精氨酸支原體肉湯培養基

豬胃消化液  500ml

牛肉浸液（1:2）500ml

葡萄糖  1.0g

酵母浸粉5.0g

L-精氨酸2.0g

酚紅0.02g

氯化鈉2.5g

pH值7.1±0.2。于121℃滅菌15分鐘。

（3）支原體半流體培養基   按（1）項處方配制，培養基中不加酚紅，加入瓊脂2.5～3.0g。

（4）支原體瓊脂培養基  按（1）項處方配制，培養基中不加酚紅，加入瓊脂13.0～15.0g。

培養基靈敏度檢查（變色單位試驗法）（1）菌種肺炎支原體（ATCC 15531）、口腔支原體（ATCC 23714），由國家藥品檢定機構分發(fā)。

（2）操作  將菌種接種于適宜的支原體培養基中，經(jīng)36℃±1℃培養至培養基變色，盲傳2代后，將培養物接種到待檢培養基中，做10倍系列稀釋?zhuān)�肺炎支原體稀釋至10^-7～10^-9，接種在支原體肉湯培養基內；口腔支原體稀釋至10^-3～10^-5，接種在精氨酸支原體肉湯培養基內。每個(gè)稀釋度接種3 支試管，置36 ℃ 士1 ℃ 培養7 ～14 天，觀(guān)察培養基變色結果。
    ( 3 )結果判定   以接種后培養基管數的2 / 3 以上呈現變色的最高稀釋度為該培養基的靈敏度。

液體培養基的靈敏度：肺炎支原體（ATCC 15531 ) 應達到10^-8 ，口腔支原體（ATCC 23714 ）應達到10^-4。

檢查法   （1）供試品如在分裝后24 小時(shí)以?xún)冗M(jìn)行支原體檢查者可貯存于2～8 ℃ ；超過(guò)24 小時(shí)應置一20 ℃ 以下貯存。

( 2 )檢查支原體采用支原體半流體培養基和支原體肉湯培養基（或支原體瓊脂培養基）。支原體半流體培養基（或瓊脂培養基）在使用前應煮沸10 ～15 分鐘，冷卻至56 ℃ 左右，然后加人滅能新生牛血清（培養基與血清體積比為8:2 ) ，并可酌情加入適量青霉素，充分搖勻。液體培養基除無(wú)需煮沸外，使用前亦應同樣補加上述成分。

 取每支裝量為10ml 的支原體半流體培養墓（已冷至36 ℃ 士1 ℃ ）和支原體肉湯培養基各4 支，每支培養基接種供試品0.5 ～1.0ml ，置36 ℃ 士1 ℃ 培養21 天。于接種后的第7 天從4 支中取2 支進(jìn)行次代培養，每1 支培養基轉種支原體半流體培養基及支原體肉湯培養基各2 支，置36 ℃ 士l ℃ 培養21 天，每隔3 天觀(guān)察1 次．
    ( 3 )結果判定   培養結束時(shí)，如接種供試品的培養基均無(wú)支原體生長(cháng)，則供試品判為合格；如疑有支原體生長(cháng)，可取加倍量供試品復試，如無(wú)支原體生長(cháng)，供試品判為合格，如仍有支原體生長(cháng)，則供試品判為不合格。

【附注】 質(zhì)量檢定部門(mén)應會(huì )同培養基制造部門(mén)定期抽檢支原體培養基靈敏度。

第二法指示細胞培養法（DNA 染色法）

 將供試品接種于指示細胞（無(wú)污染的Vero 細胞或經(jīng)國家藥品檢定機構認可的其他細胞）中培養后，用特異熒光染料染色。如供試品污染支原體，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)附在細胞表面的支原體DNA 著(zhù)色。
    試劑  （1）二苯甲酰胺熒光染料濃縮液   稱(chēng)取二苯甲酰胺熒光染料5mg ，加人100ml 不含酚紅和碳酸氫鈉的Hank 's 平衡鹽溶液中，室溫下用磁力攪拌器攪拌30～40 分鐘，使完全溶解，-20℃ 避光保存。

（2）二苯甲酰胺熒光染料工作液   無(wú)酚紅和碳酸氫鈉的Hank ' s 溶液100ml 中加人二苯甲酰胺熒光染料濃縮液lml ，混勻。

（3）固定液   醋酸:甲醉（體積比1:3 ）混合溶液。

（4）封片液   量取0.1mol / L 枸櫞酸溶液22.2ml 、0.2mol / L 磷酸氫二鈉溶液27.8ml 、甘油50.0ml ，混勻，調pH 值至5.5 。
    培養墓及指示細胞   （1） DMEM 完全培養基。

( 2 ) DMEM 無(wú)抗生素培養基。
( 3 )指示細胞（已證明無(wú)支原體污染的Vero細胞或其他傳代細胞） 取培養的Vero細胞經(jīng)消化后，制成每lml 含10⁵ 的細胞懸液，以每孔0.5ml 接種6 孔細胞培養板或其他容器，每孔再加無(wú)抗生素培養基3ml ，于36℃ 士1 ℃ 、5 ％二氧化碳條件下培養過(guò)夜，備用。

供試品處理   （1）細胞培養物   將供試品經(jīng)無(wú)抗生素培養液至少傳1 代，然后取細胞已長(cháng)滿(mǎn)的且3 天未換液的細胞培養上清液待檢。
    （2）毒種懸液    如該毒種對指示細胞可形成病變并影響結果判定時(shí)，應用對支原體無(wú)抑制作用的特異抗血清中和病毒后或用不產(chǎn)生細胞病變的另一種指示細胞進(jìn)行檢查。
    （3）其他供試品    檢查時(shí)所選用的指示細胞應為該供試品對其生長(cháng)無(wú)影響的細胞。
    測定法   于制備好的指示細胞培養板中加入供試品（細胞培養上清液）2ml （毒種或其他供試品至少lml） , 于36 ℃ 士1 ℃ 、5%二氧化碳條件下培養3～5 天。指示細胞培養物至少傳代1 次，末次傳代培養用含蓋玻片的6 孔培養板培養3～5 天后，吸出培養孔中的培養液，加人固定液5ml ，放置5 分鐘，吸出固定液，再加5ml 固定液固定10 分鐘，吸出固定液，使蓋玻片在空氣中干操，加二苯甲酰胺熒光染料（或其他DNA 染料）工作液5ml ，加蓋，室溫放置30 分鐘，吸出染液，每孔用水5ml 洗3 次，吸出水，蓋玻片于空氣中干燥，取潔凈載玻片加封片液1 滴，分別將蓋玻片面向下蓋在封片液上制成封片。用熒光顯微鏡觀(guān)察。
    用無(wú)抗生素培養基2ml 替代供試品，同法操作，作為陰性對照．
    用已知陽(yáng)性的供試品標準菌株2ml 替代供試品，同法操作，作為陽(yáng)性對照。
    結果判定  （1）陰性對照   僅見(jiàn)指示細胞的細胞核呈現黃綠色熒光。
    (2)陽(yáng)性對照   熒光顯微鏡下除細胞外，可見(jiàn)大小不等、不規則的熒光著(zhù)色顆粒。

當陰性及陽(yáng)性對照結果均成立時(shí)，試驗有效。

如供試品為陰性，則供試品判為合格；如供試品為陽(yáng)性或可疑時(shí)，應進(jìn)行重試；如供試品仍為陽(yáng)性時(shí)，供試品判為不合格。

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