細菌檢驗工作的基本技術(shù)——弧菌屬

雖然弧菌屬內包含的菌種較多，但臨床實(shí)驗室常見(jiàn)到12個(gè)菌種，其中具有明確致病作用的有霍亂弧菌、副溶血弧菌、河弧菌、擬態(tài)弧菌等。

弧菌的鑒定分兩步，首先應與相近的菌屬區別，定屬后再做種的鑒定。

    1. 與相似的菌屬區別：弧菌屬歸弧菌科。同科中還有氣單胞菌屬和鄰單胞菌屬，均為氧化酶陽(yáng)性，發(fā)酵型�；【鷮倥c其兩者的區別可依嗜鹽性、甘露醇、氨基酸及Ο/129(2,4-二氨基-6,7-二異丙基碟啶)敏感性等加以區別，Ο/129試驗用紙片濃度10μg、150μg二種，與紙片法藥敏試驗相同，出現抑菌環(huán)即判陽(yáng)性(S)。

2．霍亂弧菌的鑒定：目前我國臨床細菌室對霍亂弧菌的鑒定一般只作初步鑒定，具體方法如下：

(1)直接涂片

懸滴檢查：取患者糞便制成懸滴標本(亦可用壓滴法)，檢查細菌的動(dòng)力�；魜y弧菌無(wú)論是古典生物型或El-tor生物型均呈現極活潑的穿梭狀運動(dòng)。Ο1群霍亂多價(jià)血清制動(dòng)試驗陽(yáng)性，可作早期推測性報告。

表5-3-37           致病弧菌的生化特性(陽(yáng)性百分率)

 

染色檢查：取米泔樣糞便的絮狀物、粘液部分涂片2張，干燥后用乙醇固定，分別用革蘭染色及1:10稀釋的石炭酸復紅染色，干燥后用油鏡檢查，觀(guān)察有無(wú)革蘭陰性、呈魚(yú)群樣排列的弧菌。涂片檢查，只能對可疑患者作初步診斷參考，不能作確診依據。

(2)玻片凝集試驗：自分離平板上挑取可疑菌與霍亂多價(jià)診斷血清(即Ο1群霍亂多價(jià)血清)做玻片凝集試驗，所用血清的效價(jià)應在1：80～l：160之間，如過(guò)濃，則稀釋后再作凝集。將稀釋血清滴加在潔凈的載玻片上，挑取可疑菌落混于血清內，即刻(一般不超過(guò) 10s)出現肉眼可見(jiàn)的明顯凝集者為陽(yáng)性。菌落應以生理鹽水作對照，對照應不發(fā)生凝集。為了提高陽(yáng)性檢出率，應多挑可疑菌落進(jìn)行玻片凝集試驗。作初步鑒定試驗后，將此高度疑似菌送衛生防疫站作最后鑒定。

霍亂弧菌是重要病原菌。由于病原學(xué)及流行病學(xué)方面的需要，對Ο1群霍亂弧菌進(jìn)一步分型是必要的。國際上公認通用的區分方法有兩種：①生物分型；②抗原分型。

生物分型：根據霍亂弧菌在生物學(xué)上的差異，分為兩個(gè)生物型，命名為古典生物型和 El-tor生物型。古典生物型的毒力往往大于 El-tor生物型。古典生物型菌株的染色體上帶有兩個(gè)毒素基因，而絕大多數El-tor生物型菌株僅有一個(gè)毒素基因。在霍亂病的防治中，對菌株進(jìn)行生物分型是必要的。

兩種生物型的區分方法見(jiàn)表5-3-38。

     表5-3-38                 霍亂弧菌的生物分型

 

抗原分型：霍亂弧菌的血清學(xué)分型是依據菌體抗原。古典生物型和El-tor生物型的抗原同屬Ο1群霍亂弧菌。

Ο1群的霍亂弧菌還可以進(jìn)一步分血清型。依菌株是否具備A、B因子，分為小川、稻葉、彥島3個(gè)型別，血清分型見(jiàn)表5—3—39。

表5-3-39       霍亂弧菌生物分型和血清型

 

根據以上分型原理，鑒定致病性霍亂弧菌應遵循以下3個(gè)步驟：

    ① 可疑菌落與Ο1群抗血清凝集，確定是屬于Ο1群，還是非Ο1群弧菌。

    ② 與分型血清A、B凝集，確定血清型。

③ 作生化試驗進(jìn)行生物分型，確定是古典生物型，還是El-tor生物型。

 

3．其他弧菌的鑒定：弧菌屬中除Ο1群霍亂弧菌多次暴發(fā)世界性流行霍亂病，非Ο1群中的Ο139群最近報告暴發(fā)霍亂流行。其他弧菌種，不僅與腹瀉有關(guān)，尚可引起腸外感染。分離出上述菌株應予以鑒定。本菌屬中致病的12個(gè)菌種其生物學(xué)特性參照表5—3—37所列及表5—3—40分群鑒定。表5-3-40       弧菌屬的分群鑒定

 

鑒定中用0％NaCI生長(cháng)、氧化酶、硝酸鹽、氨基酸及發(fā)酵肌醇等幾個(gè)試驗將上述12個(gè)菌種分成6個(gè)群。分群后，僅1群、5群和6群還需要繼續區分。

霍亂弧菌與擬態(tài)弧菌的區別方法可以用蔗糖發(fā)酵試驗，前者陽(yáng)性而后者陰性(表5—3—37)。

第5群3個(gè)菌種的區別可依據甘露醇發(fā)酵和葡萄糖產(chǎn)氣試驗，3種細菌的反應特征見(jiàn)表5—3—37。

第6群的4個(gè)菌種的區別可依據水楊苷和蔗糖發(fā)酵試驗，4種細菌的反應特征見(jiàn)表5—3—37。

1992年10月發(fā)生在印度南方泰米爾納依邦(Tamilmadu)的Madas，分離到與Ο1群霍亂弧菌無(wú)關(guān)、命名為Ο139型霍亂弧菌，該菌的生物學(xué)特性符合霍亂弧菌，用Ο1群霍亂弧菌抗血清不能制動(dòng)，綿羊RBC溶血反應不定，抗多粘菌素B(50U)和復方新諾明，抗Ο/129，對MukherjeeⅣ和V型噬菌體不敏感。血清學(xué)鑒定參照衛生部生物制品檢定所生產(chǎn)Ο139霍亂弧菌診斷用試劑盒說(shuō)明書(shū)。

見(jiàn)腸桿菌科鑒定，其中氨基酸脫羧酶試驗培養基中必需含1％氯化鈉。

Ο/129敏感試驗：用含0.5％NaCl M-H瓊脂，如紙片法藥敏試驗相同接種被檢菌株，貼上含Ο/129 10μg／片、150μg／片，35℃孵育18h，記錄結果：