高生產(chǎn)率和高細胞密度發(fā)酵（下）

(三)誘導策略

      對于許多帶有誘導型啟動(dòng)子的重組微生物，只有將生長(cháng)期和產(chǎn)物形成期分開(kāi)才能獲得最大生產(chǎn)率。在流加培養中，這兩段時(shí)期的分離可以通過(guò)延遲誘導直至細胞生長(cháng)已達到高密度來(lái)實(shí)現。此外，如果質(zhì)粒穩定并且產(chǎn)物對培養物無(wú)毒，那么可以用重復補料分批培養系統來(lái)提高生產(chǎn)率。有學(xué)者采用重復補料分批培養技術(shù)培養釀酒酵母，每24 h更換50%的培養基，持續30 d，其產(chǎn)物(hirudin)的產(chǎn)量可比連續培養系統提高3倍。

      如果誘導物和產(chǎn)物對細胞都有毒性，那么應當人為地將誘導期和生長(cháng)期分開(kāi)。對于這種情況，兩級連續培養是最適宜的培養方式�？刂频谝还薜臈l件，使細胞生長(cháng)處于最適狀態(tài)之下，而誘導與產(chǎn)物形成則發(fā)生在第二罐中。例如，在恒化器中培養一株能產(chǎn)b-內酰胺酶的重組大腸桿菌，將第一罐的發(fā)酵液導入第二罐中，構成一個(gè)兩級培養系統。第二罐中添加營(yíng)養物以及IPTG作為誘導物。結果獲得300 mg活性b-內酰胺酶(相當于總蛋白的25%)，其中90%分泌至胞外。這一系統至少可以穩定運行50 d。另一相似的系統被用于培養大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白A-EcoRI蛋白融合體。培養在恒濁器中進(jìn)行，對第二罐進(jìn)行熱誘導，結果獲得了比分批發(fā)酵高6倍的比生產(chǎn)率。研究者還嘗試將生產(chǎn)重組蛋白的兩級連續培養系統與親和色譜柱相組合，試圖實(shí)現重組蛋白生產(chǎn)和純化的連續化。但由于技術(shù)上的一些原因，這種組合還未得到成功。

      比生長(cháng)速率對細胞生長(cháng)和產(chǎn)物形成均有重要作用。經(jīng)常會(huì )遇到的情況是，最適于細胞生長(cháng)的比生長(cháng)速率卻并不適于產(chǎn)物的形成或其它特性的實(shí)現。我們在培養面包酵母時(shí)發(fā)現，比生長(cháng)速率為0.2 h-1時(shí)細胞產(chǎn)率最高，而比生長(cháng)速率為0.178 h-1時(shí)酵母發(fā)酵活力最佳。針對這一現象我們提出了一個(gè)兩階段控制比生長(cháng)速率的流加培養策略，結果在一個(gè)反應器中實(shí)現了高發(fā)酵活力與高細胞產(chǎn)率的統一。

(四)細胞循環(huán)發(fā)酵

       從反應器角度來(lái)考慮獲得高細胞密度，通常采用的是細胞循環(huán)生物反應器。這種反應器利用一種切向流或中空纖維過(guò)濾器從醪液中分離細胞，細胞返回容器，無(wú)細胞醪液則以給定速率連續轉移，同時(shí)代之以新鮮培養基。利用細胞循環(huán)技術(shù)，可使細胞保留在反應器中并達到高細胞密度，而毒性廢產(chǎn)物和胞外產(chǎn)物則不斷轉移，這可以延遲或防止由細胞生長(cháng)或產(chǎn)物形成引起的反饋抑制。細胞循環(huán)生物反應器能夠適用于多種機體和生產(chǎn)系統，但它的應用也存在許多限制，主要包括∶(1)作用于進(jìn)入過(guò)濾單元的細胞的剪應力太大；(2)系統的放大存在許多實(shí)際困難。

      操作細胞循環(huán)生物反應器時(shí)必須考慮兩個(gè)因素，一是稀釋率(流速／體積)；二是循環(huán)速率(指通過(guò)過(guò)濾系統的培養基速率)。稀釋率的大小影響細胞的生長(cháng)速率，不同的實(shí)驗目的對稀釋率的要求也不同；高的循環(huán)速率可使組分混合均勻，特別適用于細胞容易凝聚或成團的情況。但循環(huán)速率過(guò)高會(huì )使作用在細胞上的剪切力過(guò)高，也會(huì )導致過(guò)濾單元膜的迅速損壞。因此，很難同時(shí)確定合適的稀釋率與循環(huán)速率，這也是限制細胞循環(huán)技術(shù)應用的一個(gè)重要因素。

      細胞循環(huán)技術(shù)可望獲得高的體積生產(chǎn)率，這對產(chǎn)物的提取非常有利。近年來(lái)循環(huán)發(fā)酵技術(shù)已廣泛用于生產(chǎn)細胞代謝物，如燃料酒精和有機酸(如丁酸)及2,3-丁二醇。Lee和Chang采用細胞循環(huán)發(fā)酵技術(shù)，重組大腸桿菌細胞干重達到145 g/L，其重組青霉素�；�酶生產(chǎn)率比分批培養提高了近10倍。對于活細胞即為所希望的產(chǎn)物的培養，細胞循環(huán)發(fā)酵也能發(fā)揮作用。如在食品工業(yè)中，為生產(chǎn)牛奶，奶酪和酸乳酪需培養不同的乳桿菌，采用細胞循環(huán)生物反應器可以很容易地提高這些生物體的的密度。