支原體培養技術(shù)

1、培養：支原體的培養37℃即可，當然，初次培養37℃，5％－10％co₂效果更好。其中，解脲支原體生長(cháng)比較快，用我所培養基，接種量10⁴－ 10⁵ccu，培養16－18h即可達到對數生長(cháng)期。人型，肺炎，24－48h即可達到對數生長(cháng)期。

2、鑒定：主要靠菌落染色、生化反應及特異性生長(cháng)抑制試驗等.

（1）Dienes菌落染色
　　Dienes染色液：
　　美藍 2.5g
　　天青－Ⅱ 1.5g
　　麥芽糖 10g
　　碳酸鈉 0.5g
　　蒸餾水 100ml

染色時(shí)，直接吸染色液覆蓋菌落，1min后，用生理鹽水洗去染色液，低倍鏡下可見(jiàn)支原體菌落呈藍色，而其他菌菌落不著(zhù)色。

（2）生化反應

根據不同采樣部位及對底物的分解或者作為能源，可以鑒別不同支原體。

解脲支原 分解尿素不分解精氨酸，生成NH₃使培養基的ph升高，酚紅指示劑變紅。

人型支原體分解L－精氨酸不分解尿素，生成NH₃使PH值升高，酚紅指示劑變紅。

肺炎和人型支原體分解葡萄糖，使pH降低，酚紅指示劑由紅變黃。

（3）在含0.002%美藍的培養基中肺炎支原體能生長(cháng)且將美藍還原而退色，其他口腔、唾液或發(fā)酵支原體均被抑制生長(cháng)，此法可鑒定肺炎支原體。

（4）分子生物學(xué)鑒定

由于支原體的基因文庫已建立，通過(guò)pcr擴增和基因探針技術(shù)可以對支原體進(jìn)行鑒定。

如果要自己配制培養基，現提供幾種配方：

基礎培養基：Hayflick培養基（PPLO培養基），牛心粉 50g 蛋白胨 10g 氯化鈉 5g 加14g瓊脂粉為固體培養基

（1） 肺炎支原體培養基

基礎培養基 70ml
　　牛血清 （滅活） 20ml
　　25％的酵母浸液 10ml
　　50％葡萄糖 1－2ml 0.4
　　酚紅 0.5ml
　　制霉素 0.001g
　　青霉素 10萬(wàn)IU
　　pH 7.8

（2）人型支原體培養基

基礎培養基 70ml
　　馬血清 20ml 25％的酵母浸液 10ml
　　30％L－精氨酸 0.33ml
　　0.4％酚紅 0.5ml
　　制霉素 0.001g
　　青霉素 10萬(wàn)IU
　　pH 6.3

（3）解脲支原體培養基

基礎培養基 70ml
　　馬血清 20ml
　　25％的酵母浸液 10ml
　　30％尿素0.33ml
　　0.4％酚紅 0.5ml
　　制霉素 0.001g
　　青霉素 10萬(wàn)IU
　　pH 6.0

注：由于支原體能在人工培養基上生長(cháng)，但是營(yíng)養要求較高，需要提供膽 固醇和酵母才能生長(cháng)。以上配方中，馬（牛).血清提供膽固醇，酵母浸液提供酵母。