桿狀病毒滴度檢測

錄入時(shí)間:2010-5-26 15:54:35 來(lái)源：易生物

實(shí)驗目的：檢測病毒滴度

實(shí)驗原理：根據噬菌斑數計算病毒滴度

材料與試劑：

1、6孔板，12ml離心管，100ml無(wú)菌玻璃瓶，無(wú)菌吸管，70℃水浴鍋，無(wú)菌水

2、桿狀病毒， SF9：5×10⁵cells/ml

3、4% agarose gel：2g agrose + 50ml 水，高壓滅菌

4、2×Grace（unsupplemented）：9.14g粉末（invitrogen）+0.07gNaHCO₃+H₂O，調PH6.1，定容至100ml，無(wú)菌過(guò)濾

5、supplemented Grace：1×Grace添加3.33mg/ml Lactalbumin，3.33mg/ml yeastolate，無(wú)菌過(guò)濾

6、高溫滅活FBS

方法：

1、無(wú)菌條件下，2ml/孔細胞（5×10⁵cells/ml）種入6孔板，室溫孵育1h使其貼壁，孵育后鏡檢其貼壁程度

2、將4% agarose gel放入70℃水浴鍋融解，空100ml無(wú)菌瓶與2×Grace放入40℃水浴鍋預熱

3、將桿狀病毒用無(wú)血清supplemented Grace梯度稀釋?zhuān)?0^-1~10^-8

4、棄6孔板內上清，快速加入稀釋好的病毒，1ml/孔，復孔，室溫孵育1h

6、配置上層瓊脂：加20ml高溫滅活FBS到2×Grace 100ml，25ml 2×Grace（含FBS）+12.5ml 無(wú)菌水+12.5ml 4% agarose gel，至預熱的100ml無(wú)菌瓶，輕輕混勻，放入37℃水浴鍋備用

7、棄6孔板內上清，快速加2ml上層瓊脂，以防菌層干燥，靜置10-20min使其凝固

8、將6孔板放入27℃培養箱，培養4－10天

9、計數板中噬菌斑，直至連續兩天無(wú)變化，加1mg/ml中性紅0.5ml，室溫孵育2h后計數噬菌斑

注：

病毒滴度（pfu/ml）=1/稀釋倍數×噬菌斑數×1/每孔接種體積

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