諾如病毒ELISA檢測

1.出現癥狀后72小時(shí)內采樣。

2.糞便量盡量不少于5ml。

3.貯存于2～8℃，但最多不能超過(guò)3天；長(cháng)期貯存應在－20℃或－70℃。
4.成形便和肛拭子診斷意義較小，一般不采樣。

      IDEIA™ norovirus試劑盒（DakoCytomation公司）
     1000µl和200µl微量加樣槍及相應不帶濾芯的槍頭
     吸水性能好的衛生紙
     去離子水(無(wú)須高壓)或蒸餾水
     渦漩震蕩器
     離心機
     50ml管、1.5ml EP管及相應的架子 

     酶標儀

     洗板機

      將試劑和待檢測標本置于室溫（15～30℃）30min。
     陰性對照：將1ml樣品稀釋液（sample diluent）加至標記好的小瓶中作為陰性對照。
     陽(yáng)性對照：1ml陽(yáng)性對照液（positive control）溶解一瓶陽(yáng)性對照， 顛倒混勻。未用完的陽(yáng)性對照可在2～8℃貯存1個(gè)月，長(cháng)期貯存應分裝存于-20℃。
     每次檢測均至少一個(gè)陽(yáng)性對照和一個(gè)陰性對照。
     空白對照：空氣
     洗液的配制：1倍體積的洗液濃縮液（WASH BUFFER×25）加24倍體積的去離子水，當天用當天配。

加入1ml樣品稀釋液至1.5ml 小離心管中，然后，加入0.1g固體糞便標本或0.1ml液體糞便標本，置于漩渦震蕩器充分混勻，室溫靜置10min，室溫下≥5000rpm離心5min，取上清進(jìn)行檢測或置-20℃冰箱保存備用。

1、將需要數量的微孔板置于微孔板架上。

2、每孔加入100µl 10％便懸液以及陰性對照，陽(yáng)性對照。

3、每孔加入2滴（或100µl）酶結合物（conjugate），用槍頭輕柔混勻（上下5次左右），20～30℃靜置60±5min。

4、每孔加入350µl洗液（用手輕微搖動(dòng)1 min左右），棄去洗液，在衛生紙上拍干，共洗5次。

5、每孔加入2滴（或100µl）底物液（Substrate），20～30℃靜置30min。待藍色顯現后迅速觀(guān)察顏色。

6、每孔加入2滴（或100µl）終止液（Stop solution），充分混勻。

7、讀取OD450值，打印輸出或記錄值。結果必須在加入終止液后30min內讀取。

陰性對照：肉眼觀(guān)察無(wú)色或OD450值<0.15。

陽(yáng)性對照：肉眼觀(guān)察呈現獨特的藍色或OD450值>0.50。

臨界值（cut-off value）：OD450值＝陰性對照OD450值＋0.10。

標本：

a)肉眼觀(guān)察藍色比陰性對照顏色深判定為陽(yáng)性，肉眼觀(guān)察無(wú)色判定為陰性。

b)OD450值大于臨界值判定為陽(yáng)性，小于臨界值判定為陰性，OD450值在臨界值±0.01

范圍內判定為可疑，應重復檢測或重新取樣。判斷陰陽(yáng)結果按上述方法進(jìn)行。若OD450值在臨界值仍在±0.01范圍內，仍判定為可疑，對于可疑樣品應用PCR方法來(lái)判定最終結果。

1、便標本處理時(shí)震蕩時(shí)應充分震蕩，特別是成形便或稀便，以便于病毒從標本中釋放出來(lái)。

2、加酶結合物（conjugate）后應用槍頭輕柔混勻（上下5次左右），以便于抗原抗體充分結合。

3、讀取吸光度應在加完終止液之后30min內完成。

4、所有標本和陽(yáng)性對照必須被當作具有潛在感染性的物質(zhì)進(jìn)行處理。

5、打開(kāi)后的96微孔板應置于可封口的有干燥劑的口袋中貯存于2～8℃，打開(kāi)后6周內用完。

6、終止液中含0.46mol/L硫酸，避免接觸到皮膚和眼睛。如果終止液接觸到這些部位立即用水沖洗。

7、底物液避光保存，不使用已經(jīng)變藍的底物液。

8、避免試劑、金屬離子、氧化性物質(zhì)及微生物污染。

9、因標本中可能存在某些腺病毒，該病毒具有與眼結膜結合的能力，在檢測過(guò)程中應避免手與眼的接觸。

10、ELISA板微孔不能反復使用。