苯硫氨酯、奧芬達唑和苯硫苯咪唑檢測方法

 氫氧化鈉溶液
二乙烯基苯基－N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱（200 mg）：在內徑 12～13 mm聚乙烯管中裝填200mg二乙烯基苯基－N－乙烯基吡咯烷酮共聚物或具有同等分離特性的物質(zhì)。
七氟丁酸： 七氟正丁酸
苯硫氨酯標準品：含苯硫氨酯99%以上，熔點(diǎn)為129℃～130℃。
苯硫苯咪唑標準品：含苯硫苯咪唑98%以上，熔點(diǎn)為233℃（分解）。

4．試驗溶液的配制

1) 提取方法
稱(chēng)取5.0g攪碎混合均勻的樣品，加入30mL乙腈、20mL乙腈飽和正己烷和10g無(wú)水硫酸鈉均質(zhì)后，以每分鐘3,000轉離心分離5分鐘。乙腈層和正己烷層移入分液漏斗中，收集乙腈層。正己烷層加入離心分離的殘留物中，再加入20mL乙腈，激烈振蕩混合后，以每分鐘3,000轉離心分離5分鐘。舍棄正己烷層，將乙腈層合并于前面的乙腈層中，加入10 mL正丙醇，40℃以下濃縮，除去溶劑。
2) 砜化
將1)所得的殘留物溶解于0.5 mL無(wú)水乙酸后，加入0.5 mL過(guò)氧化氫混合，室溫下放置30分鐘。加入5 mL 1 mol/L 亞硫酸鈉溶液混合，室溫下放置10分鐘后，加入10 mL 1 mol/L 氫氧化鈉溶液。
3) 凈化方法
在二乙烯基苯基－ N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱（200 mg）中順次注入10m L甲醇、10mL水，舍棄流出液。柱中注入2)所得的溶液后，注入10mL水，舍棄流出液。注入10mL甲醇，溶出液在40℃以下濃縮，除去溶劑。殘留物中加入1 mL甲醇溶解，作為試驗溶液。

5．標準曲線(xiàn)的制作

苯硫氨酯試驗時(shí)，將苯硫氨酯標準品配制成 0.05～50 mg/L 的甲醇溶液數點(diǎn)。奧芬達唑、奧芬達唑砜和苯硫苯咪唑試驗時(shí)，將苯硫苯咪唑標準品配制成0.05～50 mg/L 的甲醇溶液數點(diǎn)。將1 mL各標準品的甲醇溶液在40℃以下濃縮，除去溶劑。殘留物按照與4．試驗溶液的制備中2)砜化和3)凈化方法相同操作，分別注入HPLC 中，用峰高法或峰面積法繪制成標準曲線(xiàn)。

6．定量試驗

注入試驗溶液于HPLC中，按照5．的標準曲線(xiàn)分別求得苯硫氨酯和苯硫苯咪唑的含量，按下式求得奧芬達唑砜的含量。
奧芬達唑砜的含量＝（苯硫氨酯的含量× 0.74）＋（苯硫苯咪唑的含量× 1.11）

7．測定條件

1) 苯硫氨酯試驗
① HPLC
檢測器： UV 或DAD（波長(cháng) 280 nm 附近的最大波長(cháng)）
柱：十八烷基甲硅烷基化硅膠（粒徑 2～5 µm），內徑2.0～6.0 mm，長(cháng)100～250 mm。
柱溫： 40℃
流動(dòng)相： 乙腈：0.005 mol/L七氟丁酸溶液（2:3）的混合溶液
保留時(shí)間標準： 7～10 分鐘
② LC/MS
柱：十八烷基甲硅烷基化硅膠（粒徑 2～5 µm），內徑2.0～6.0 mm，長(cháng)100～250 mm。
柱溫：40℃
流動(dòng)相：乙腈：0.005 mol/L七氟丁酸溶液（2:3）的混合溶液。
主離子 ( m/z)： ESI+ 479
保留時(shí)間標準： 7～10 分鐘
2) 奧芬達唑、奧芬達唑砜和苯硫苯咪唑試驗
① HPLC
檢測器： UV 或DAD（波長(cháng) 290 nm附近的最大波長(cháng)）
柱：十八烷基甲硅烷基化硅膠（粒徑 2～5 µm），內徑2.0～6.0 mm，長(cháng)100～250 mm。
柱溫： 40℃
流動(dòng)相：乙腈：0.005 mol/L七氟丁酸溶液（3:7）的混合溶液。
② LC/MS
柱：十八烷基甲硅烷基化硅膠（粒徑 2～5 µm），內徑2.0～6.0 mm，長(cháng)100～250 mm。
柱溫： 40℃
流動(dòng)相：乙腈：0.005 mol/L七氟丁酸溶液（3:7）的混合溶液。
主離子 ( m/z)： ESI+ 332
保留時(shí)間標準： 7～10 分鐘

8．定量限

0.01 mg/kg（奧芬達唑，奧芬達唑砜，苯硫氨酯和苯硫苯咪唑中分別以?shī)W芬達唑砜計）

9．注意事項

1)檢測方法概述
本方法用乙腈從樣品中提取奧芬達唑，奧芬達唑砜，苯硫氨酯和苯硫苯咪唑，乙腈／正己烷分配脫脂后，用無(wú)水乙酸和30%過(guò)氧化氫將苯硫氨酯氧化成砜體、苯硫苯咪唑和奧芬達唑氧化為奧芬達唑砜，HPLC(UV 或DAD)分別測定，LC/MS確證。
2) 注意點(diǎn)
① 因無(wú)水乙酸、30%過(guò)氧化氫、亞硫酸鈉的反應性高，操作中要小心。此外，因這些試劑經(jīng)常容易變化，保管時(shí)要小心。
② 對于砜化，加入1 mol/L 亞硫酸鈉溶液和1 mol/L 氫氧化鈉溶液時(shí)，因激烈發(fā)熱要小心。
③ 確認砜化結束，根據需要用HPLC和LC/MS測定奧芬達唑，苯硫氨酯和苯硫苯咪唑。
作為各測定條件的例子：使用內徑 3.0 mm，長(cháng)150 mm 的柱時(shí)，
奧芬達唑：流動(dòng)相：乙腈：0.05%三氟乙酸（1:4）的混合溶液，流速：0.4 mL/min，UV 測定波長(cháng)：290 nm，MS 測定離子： ESI+ 316 ( m/z)，保留時(shí)間： 8 分鐘。
苯硫氨酯：流動(dòng)相：乙腈：0.05%三氟乙酸（1:1）的混合溶液，流速：0.4 mL/min，UV測定波長(cháng)：280 nm，MS測定離子： ESI+ 447 ( m/z)，保留時(shí)間：約11 分鐘。
苯硫苯咪唑：流動(dòng)相：乙腈：0.05%三氟乙酸（2:3）的混合溶液，流速：0.4 mL/min，UV測定波長(cháng)：290 nm，MS 測定離子： ESI+ 300 ( m/z)，保留時(shí)間：約5分鐘。
其他的測定條件按照7．測定條件的進(jìn)行。
④ 在二乙烯基苯基－N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱（200 mg）中注入砜化所得的溶液時(shí)，如殘留過(guò)氧化氫，小柱中會(huì )分解產(chǎn)生氣泡，使溶液流出不一致。此時(shí)，加壓吸引強制流出。

 

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