微生物生長(cháng)的檢測方法一

摘要：

微生物的檢測，無(wú)論在理論研究還是在生產(chǎn)實(shí)踐中都具有重要的意義，本文分生長(cháng)量測定法，微生物計數法，生理指標法和商業(yè)化快速微生物檢測簡(jiǎn)要介紹了利用微生物重量，體積，大小，生理代謝物等指標的二十余種常用的檢測方法，簡(jiǎn)要介紹了這些方法的原理，應用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)。

概述：

一個(gè)微生物細胞在合適的外界條件下，不斷的吸收營(yíng)養物質(zhì)，并按自己的代謝方式進(jìn)行新陳代謝。如果同化作用的速度超過(guò)了異化作用，則其原生質(zhì)的總量（重量，體積，大�。┚筒粩嘣黾�，于是出現了個(gè)體的生長(cháng)現象。如果這是一種平衡生長(cháng)，即各細胞組分是按恰當的比例增長(cháng)時(shí)，則達到一定程度后就會(huì )發(fā)生繁殖，從而引起個(gè)體數目的增加，這時(shí)，原有的個(gè)體已經(jīng)發(fā)展成一個(gè)群體。隨著(zhù)群體中各個(gè)個(gè)體的進(jìn)一步生長(cháng)，就引起了這一群體的生長(cháng)，這可從其體積、重量、密度或濃度作指標來(lái)衡量。微生物的生長(cháng)不同于其他生物的生長(cháng)，微生物的個(gè)體生長(cháng)在科研上有一定困難，通常情況下也沒(méi)有實(shí)際意義。微生物是以量取勝的，因此，微生物的生長(cháng)通常指群體的擴增。微生物的生長(cháng)繁殖是其在內外各種環(huán)境因素相互作用下的綜合反映。因此生長(cháng)繁殖情況就可作為研究各種生理生化和遺傳等問(wèn)題的重要指標，同時(shí)，微生物在生產(chǎn)實(shí)踐上的各種應用或是對致病，霉腐微生物的防治都和他們的生長(cháng)抑制緊密相關(guān)。所以有必要介紹一下微生物生長(cháng)情況的檢測方法。既然生長(cháng)意味著(zhù)原生質(zhì)含量的增加，所以測定的方法也都直接或間接的以次為根據，而測定繁殖則都要建立在計數這一基礎上。微生物生長(cháng)的衡量，可以從其重量，體積，密度，濃度，做指標來(lái)進(jìn)行衡量。

1、 體積測量法：又稱(chēng)測菌絲濃度法。

通過(guò)測定一定體積培養液中所含菌絲的量來(lái)反映微生物的生長(cháng)狀況。方法是，取一定量的待測培養液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設定一定的離心時(shí)間（如5分鐘）和轉速（如5000 rpm），離心后，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(cháng)的一個(gè)重要監測指標。這種方法比較粗放，簡(jiǎn)便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營(yíng)養物，結果會(huì )有一定偏差。

2、 稱(chēng)干重發(fā)法：

可用離心或過(guò)濾法測定。一般干重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測培養液倒入離心管中，設定一定的離心時(shí)間和轉速，進(jìn)行離心，并用清水離心洗滌1-5次，進(jìn)行干燥。干燥可用烘箱在1050C或1000C下烘干，或采用紅外線(xiàn)烘干，也可在800C或400C下真空干燥，干燥后稱(chēng)重。如用過(guò)濾法，絲狀真菌可用濾紙過(guò)濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過(guò)濾，過(guò)濾后用少量水洗滌，在400C下進(jìn)行真空干燥。稱(chēng)干重發(fā)法較為煩瑣，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時(shí)，常采用這種方法，如活性干酵母（activity dry yeast, ADY）,一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。

3、 比濁法：

微生物的生長(cháng)引起培養物混濁度的增高。通過(guò)紫外分光光度計測定一定波長(cháng)下的吸光值，判斷微生物的生長(cháng)狀況。對某一培養物內的菌體生長(cháng)作定時(shí)跟蹤時(shí)，可采用一種特制的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時(shí)測定其生長(cháng)情況，而不必取菌液。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長(cháng)監測。如我所使用UNICO公司的紫外-可見(jiàn)分光光度計，在波長(cháng)600nm 處用比色管定時(shí)測定發(fā)酵液的吸光光度值OD600，以此監控E.Coli的生長(cháng)及誘導時(shí)間。

4、 菌絲長(cháng)度測量法：

對于絲狀真菌和一些放線(xiàn)菌，可以在培養基上測定一定時(shí)間內菌絲生長(cháng)的長(cháng)度，或是利用一只一端開(kāi)口并帶有刻度的細玻璃管，到入合適的培養基，臥放，在開(kāi)口的一端接種微生物，一段時(shí)間后記錄其菌絲生長(cháng)長(cháng)度，借此衡量絲狀微生物的生長(cháng)。

1、 血球計數板法:

血球計數板是一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個(gè)平臺，兩嵴的表比兩平臺的表面高0.1 mm，每個(gè)平臺上刻有不同規格的格網(wǎng)，中央0.1 mm2面積上刻有400個(gè)小方格。通過(guò)油鏡觀(guān)察，統計一定大格內微生物的數量，即可算出1毫升菌液中所含的菌體數。這種方法簡(jiǎn)便，直觀(guān)，快捷，但只適宜于單細胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計數，并且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。

2、 染色計數法：

為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀(guān)察計數，而直接用血球計數板法又無(wú)法區分死細胞和活細胞的不足，人們發(fā)明了染色計數法。借助不同的染料對菌體進(jìn)行適當的染色，可以更方便的在顯微鏡下進(jìn)行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液，染色后在顯微鏡下觀(guān)察，活細胞為無(wú)色，而死細胞為藍色。

3、 比例計數法：

將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細胞）濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的細胞濃度。這種計數方法比較粗放。并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標準。

4、 液體稀釋法：

對未知菌樣做連續十倍系列稀釋?zhuān)�根據估計數，從最適宜的三個(gè)連續的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15只裝培養液的試管中，經(jīng)培養后記錄每個(gè)稀釋度出現生長(cháng)的試管數，然后查最大或然數表MPN（most probably number）得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。

5、 平板菌落計數法：

這是一種最常用的活菌計數法。將待測菌液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)�取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合，或將菌液涂布于已凝固的固體培養基平板上。保溫培養后，用平板上出現的菌落數乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數。一般以直徑9cm的平板上出現50-500個(gè)菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術(shù)。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數，而且同時(shí)將菌液中的細菌進(jìn)行了一次分離培養，獲得了單克隆。

6、 試劑紙法：

在平板計數法的基礎上，發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計數用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無(wú)色）待蘸取測試菌液后置密封包裝袋中培養。短期培養后在濾紙上出現一定密度的玫瑰色微小菌落與標準紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數快捷準確，相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。

7、 膜過(guò)濾法：

用特殊的濾膜過(guò)濾一定體積的含菌樣品，經(jīng)丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀(guān)察細胞的熒光，活細胞會(huì )發(fā)橙色熒光，而死細胞則發(fā)綠色熒光。