吡利霉素檢測方法
錄入時(shí)間:2010-3-19 14:40:33
來(lái)源：青島海博
1．分析目標化合物
吡利霉素（對于肝臟，吡利霉素和吡利霉素亞砜）
2．儀器設備
液相色譜—質(zhì)譜儀。
3．試劑
除下列試劑外，使用附錄2所列試劑。
鹽酸吡利霉素一水合物標準品：含鹽酸吡利霉素一水合物97%以上，熔點(diǎn)為210.5 ℃～ 212.5 ℃。
二乙烯基苯－ N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱（60 mg）：內徑12～13mm 聚乙烯管中填充60mg二乙烯基苯－ N－乙烯基吡咯烷酮共聚物或具有同等分離特性的物質(zhì)。
4．試驗溶液的制備
1) 肌肉
①提取方法
盡可能除去脂肪層，攪碎混合均勻后，稱(chēng)取其5.00g。加入100 mL甲醇：0.2%偏磷酸溶液(3：7)混合溶液，攪拌后，用涂布2～3 mm 厚硅藻土的濾紙抽濾于磨口減壓濃縮器中。取出濾紙上的殘留物，加入20mL甲醇：0.2%偏磷酸溶液(3：7)混合溶液，攪拌后，按上述同樣操作，合并濾液于減壓濃縮器中，40℃以下濃縮至約30mL。
②凈化方法
在二乙烯基苯－N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱（60 mg）中，依次注入5mL甲醇和5mL水，舍棄流出液。柱中注入①提取方法所得的溶液后，注入5mL水，舍棄流出液。注入5mL甲醇，收集流出液于磨口減壓濃縮器中，40℃以下除去甲醇。殘留物中加入1.0mL乙腈：0.05%三氟乙酸（1：3）混合溶液溶解，此為試驗溶液。
2)脂肪
①提取方法
盡可能除去肌肉層，攪碎混合均勻后，稱(chēng)取其5.00g。加入30 mL正己烷和70 mL 0.2%的偏磷酸溶液，攪拌后，以每分鐘3000轉離心分離5分鐘。收集0.2%偏磷酸層，用涂布2～3mm 厚硅藻土的濾紙抽濾于磨口減壓濃縮器中。取出濾紙上的殘留物，加入20mL甲醇：0.2%偏磷酸溶液(3：7)混合溶液，攪拌后，按上述同樣操作，合并濾液于減壓濃縮器中，40℃以下濃縮至約30mL。
②凈化方法
采用1）肌肉的②凈化方法。
3)肝臟，腎臟，奶及其它食用部分：
①提取方法
肝臟：攪碎混合均勻后，稱(chēng)取其5.00g，在37 ℃下放置24小時(shí)。
腎臟及其它食用部分：攪碎混合均勻后，稱(chēng)取其5.00g。
奶：稱(chēng)取5.00g樣品。
加入100 mL甲醇：0.2%偏磷酸溶液(3：7)混合溶液，攪拌后，加入3g硅藻土混合，用涂布2～3 mm 厚硅藻土的濾紙抽濾于磨口減壓濃縮器中。濾紙上的殘留物中加入20mL甲醇：0.2%偏磷酸溶液(3：7)混合溶液，再攪拌后，按上述同樣操作，合并濾液于減壓濃縮器中，40℃以下濃縮至約30mL。
②凈化方法
采用1）肌肉的②凈化方法。
5．標準曲線(xiàn)的制作
將鹽酸吡利霉素一水合物標準品配制成10 mg（以吡利霉素計）/100mL甲醇溶液，用乙腈：0.05%三氟乙酸混合溶液稀釋?zhuān)渲瞥稍?/SPAN>0.05 ～10 mg（以吡利霉素計）/L范圍的溶液數點(diǎn)，分別注入LC/MS，用峰高法或面積法繪制成標準曲線(xiàn)。
6．定量試驗
注入試驗溶液于LC/MS中，根據5的標準曲線(xiàn)求出吡利霉素的含量。
7．測定條件
LC/MS
柱：十八烷基甲硅烷基化硅膠（粒徑2 ～5 μm），內徑2.0～6.0 mm、長(cháng)100 ～250mm不銹鋼管。
柱溫：40 ℃
流動(dòng)相：乙腈：0.05%三氟乙酸（1:3）混合溶液。
主離子(m/z)： ESI+ 411
保留時(shí)間標準：4～6 分鐘
8．定量限
0.01 mg/kg。
9．注意事項
1)檢測方法概述
肝臟樣品，因代謝物吡利霉素亞砜要轉變?yōu)檫晾顾�，所以�?/SPAN>37℃放置24 小時(shí)。
本方法用甲醇與0.2%偏磷酸溶液的混合溶液從樣品中提取吡利霉素，經(jīng)二乙烯基苯－ N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱凈化后，LC/MS測定和確證。
2) 注意點(diǎn)
① 對于LC/MS，標準溶液和試驗溶液的標準進(jìn)樣量，內徑3.0 mm 柱子為10 μL。因柱子和儀器設備使最佳進(jìn)樣量不同，必須研究最佳的進(jìn)樣量。
②采用主離子的儀器設備，因為最適合的離子化方法、生成的離子不同，要研究?jì)x器設備最合適的條件。
對于主離子之外的確證離子，ESI+為363(m/z)。
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