芐青霉素檢測方法

1．分析目標化合物

芐青霉素

2、試劑

    除下列試劑外，使用附錄2所列試劑。
    繼代保存用培養基：由酪蛋白氨基酸、肉湯、氯化鈉、瓊脂等組成的培養基。
    檢査用平板：在1000mL加溫溶解后保持55℃的試驗用培養基中加入5mL試驗菌液，混合后，注入8mL于內徑85mm培養皿中，水平保持至凝固。
    試驗菌液：將繼代培養基中繼代培養的Bacillus stearothermophilus var.calidolactisC―953菌株接種到增殖用培養基中，在55℃培養6小時(shí)，作為試驗菌液。
    試驗用培養基：由肉牛心湯、胨、氯化鈉、瓊脂等組成。
    増殖用培養基：由酵母膏，トリプトン，葡萄糖等組成。
    圓盤(pán)：使用直徑10mm，厚1.5mm 的牛津杯。
    磷酸緩沖液（pH6.0）：將7.0g磷酸二氫鉀溶解在500mL水中，6.0g磷酸氫二鈉溶解在500mL水中，將二份溶液混合。

3．標準品

芐青霉素鈉：含芐青霉素1,650 単位／mg 以上，熔點(diǎn)為129℃～130℃。

4．試驗溶液的制備

a  提取方法
①肌肉、肝臟和腎臟：
    肌肉：盡可能除去脂肪層，攪碎混合均勻后，稱(chēng)取其5. 0g。
    肝臟和腎臟：攪碎混合均勻后，稱(chēng)取其5. 00g。
    加入30mL水，攪拌后，5mL 0.17mol／L 硫酸和5mL 5％鎢酸鈉溶液，用振蕩器激烈振蕩5分鐘，以每分鐘3500轉離心分離5分鐘后，水層抽濾。沈淀中加入20mL水，用振蕩器激烈振蕩5分鐘后，按上述同樣操作離心分離，水層抽濾。合并兩濾液，加入8 mL 25%氯化鈉溶液。
②奶
    稱(chēng)取25.0g樣品，加入25mL水和5mL飽和乙二胺四乙酸二鈉溶液，用振蕩器激烈振蕩5分鐘后，以每分鐘3500轉離心分離5分鐘，水層抽濾。濾液中加入6mL 25%氯化鈉溶液。
b 凈化方法
    在十八烷基甲硅烷基化硅膠小柱（500mg）中，順次注入10mL乙腈、10mL水和5mL 2%氯化鈉溶液，棄去流出液。柱中注入a 提取方法所得的溶液后，順次注入10mL 2%氯化鈉溶液和10mL水，棄去流出液。注入5mL乙腈：水（4：1）混合溶液，流出液中加入10mL乙腈：水（4：1）混合溶液，此為試驗溶液。

5、操作方法

a 定量試驗
    取5mL試驗溶液于磨口減壓濃縮器中，在40℃以下除去乙腈和水，殘留物中加入1mL磷酸緩沖液（Ph6.0）溶解。將此溶液它吸入圓盤(pán)上，在55℃培養17小時(shí)，與標準品抑菌圈直徑比較，進(jìn)行定量。
b 確證試驗
    在玻璃板上涂布0.1mm厚的薄層色譜用微晶纖維素，用作薄層板。取5mL試驗溶液于磨口減壓濃縮器中的，在40℃以下除去乙腈和水，殘留物中加入1.0mL丙酮：水 (1：1) 混合溶液溶解。將4µl溶液點(diǎn)在薄層板上，用丙酮：水：1－戊醇 (1：3：4) 混合溶液作為展開(kāi)溶劑，根據上升法展開(kāi)100mm后，風(fēng)干。在薄層板上生成薄層，放入四方型培養皿中。在1,000mL經(jīng)加溫溶解后保持55℃的試驗用培養基中加入5mL試驗菌液的混合液分別注入2mm的厚薄層板上，保持水平凝固。放置1小時(shí)后，在55℃培養17小時(shí)，與標準品的抑菌圈的Rf 值進(jìn)行比較。

6．定量界

肌肉、肝臟和腎臟：0.005mg/kg，奶：0.001mg/kg

7．注意事項

（1） 標準溶液的配制
①將標準品溶解在磷酸緩沖液（pH6.0）作為標準原液（芐青霉素1,667,000單位／l，1,000mg／L）。本標準原液保存在－20℃，1年內穩定。
②用磷酸緩沖液（pH 6.0）將標準原液遞減稀釋?zhuān)�作為定量試驗用標準溶液�?
③ 用50％丙酮溶液將標準原液遞減稀釋?zhuān)�作為確證試驗（薄層色譜法）用標準溶液。