禽流感病毒RNA提取方法

一、用異硫氰酸胍提取

1.取200ul樣品數+陰性對照+陽(yáng)性對照個(gè)1.5ml滅菌eppendorf管

2.加600ul異硫氰酸胍，然后加入對照和樣品，再加200ul氯仿，顛倒混勻

3.13000rpm離心15min

4.在第3步離心快結束時(shí)，另取同樣多eppendorf管，加入400ul -20度預冷的異丙醇

5.取第3步離心的上清（一定不要吸取到中間白色層，第3步離心結束往外拿的時(shí)候，管子盡量不要傾斜）轉移到第4步準備的管中，顛倒混勻

6.13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體

7.加600ul 75％乙醇，顛倒數次以洗滌殘存異丙醇

8.13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體

9.4000rpm離心10sec，將管壁殘存液體甩到底部，用微量槍頭吸干，室溫干燥2－3min（不可過(guò)分干燥，防止下一步RNA不溶解）

10.加入20ul DEPE水(加入depc的純水高壓后的水即為DEPE水)，輕輕混勻溶解RNA。2000rpm離心5sec，冰上保存備用（最好2小時(shí)內使用，以免RNA降解）

二、用Trizol LS提取

應用Trizol LS提取病毒RNA所提取物為血清、血液、細胞培養液、雞胚尿囊液等液體中的病毒。提取時(shí)盡量在人少時(shí)進(jìn)行，防止空氣中RNA酶的污染。所用一切物品也應是無(wú)RNA酶的。

1.在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入TRIzol LS 500ul，充分混勻，室溫放置10min。

2.加入200ul的氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管（溶液充分乳化，成乳白狀，無(wú)分相現象），室溫放置10min （由于氯仿沸點(diǎn)低、易揮發(fā)，振蕩時(shí)離心管可能爆開(kāi)，小心）。

3.離心 4℃、13000r/min、15min，取上層液相移入另一管（切忌吸動(dòng)白色中間相）。

4.加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10min。

5.離心 4℃、13000r/min、15min，（這時(shí)乍一看會(huì )發(fā)現管子里好像沒(méi)有東西，再仔細看看，會(huì )發(fā)現靠近管底的壁上有一星點(diǎn)的白色沉淀物，就是它了）用槍小心吸去所有上清。

6.1ml75%乙醇洗一遍，離心 4℃、8000r/min、10min，（這時(shí)又會(huì )發(fā)現管子沒(méi)東西了，不要擔心，有的，但是因為量太少看不見(jiàn)罷了）用槍小心吸去所有上清，在超凈臺中干燥5min。

7.加入適量DEPC處理水。（如果材料來(lái)源豐富的話(huà)，加入的水量為下一步RT的total減去其他試劑的量；若要省著(zhù)點(diǎn)用，則自己看著(zhù)辦了，盡量不要加太多的水）。

8.建議立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇后凍存于－70℃，可保存一年；若加入DEPC水后則只能在－20℃保存1個(gè)月左右。

三、Trizol法提禽流感病毒

1.取雞胚尿囊液，加入5-10倍體積 Trizol液，混勻；

2.室溫放置5分鐘，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒；

3.取上層水相于一新的離心管，按每ml Trizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘；

4.棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，混勻，4℃下7500g離心5分鐘；

5.重復第4步；

6.小心棄去上清液，然后室溫干燥5-10分鐘，注意不要干燥過(guò)分，否則會(huì )降低RNA的溶解度；

7.然后將RNA溶于水中，放置10分鐘。

1.整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作；