出血性大腸菌及檢驗

一、概況

　　  腸出血性大腸桿菌（EHEC）是能引起人的出血性腹瀉和腸炎的一群大腸埃希氏菌。以O157:H7血清型為代表菌株。

　　  腸出血性大腸桿菌感染可引起輕度腹瀉、出血性結腸炎（HC）、溶血性尿毒綜合癥（HUS），血栓性血小板減少性紫癜（TTP）等。其中HUS病程兇險，易造成急性腎衰竭乃至死亡。

　　  1982年美國首次報道了由EHEC O157:H7引起的出血性腸炎暴發(fā)。此后，世界各地陸續報道了該菌引起的感染，并有上升趨勢。1996年在日本發(fā)生的EHEC O157:H7的暴發(fā)流行，引起出血性腹瀉，先后波及30多個(gè)都、府、縣，感染近萬(wàn)人，并造成12人死亡，引起了全世界的關(guān)注。此外，美國、加拿大、瑞典、澳大利亞、英國的蘇格蘭和威爾士等國家和地區也相繼報道了EHEC的散發(fā)性感染和暴發(fā)流行。日本、加拿大及瑞士等國已將EHEC O157:H7列為必須報告的傳染病，予以高度重視。我國于1988年首次分離到EHEC O157:H7，從已有的流行病調查資料來(lái)看，我國亦存在EHEC的散發(fā)病例，但尚未有暴發(fā)流行的報道。

　　  EHEC O157:H7引起的感染有明顯的季節性，多發(fā)生于夏秋兩季，7-8月為發(fā)病高峰。在地區分布上，多發(fā)生于發(fā)達國家，主要以散發(fā)性感染為主。在年齡分布上，兒童與老年人的發(fā)病率明顯高于其他年齡組，且并發(fā)HUS和TTP的機率較高。最易分離到 O157:H7的年齡為5-9歲（0.9%）和50-59歲（0.89%）。農場(chǎng)動(dòng)物，尤其是反芻動(dòng)物，構成EHEC O157:H7在世界范圍內的主要貯存宿主。O157:H7在牛中的流行報告范圍為0.1-16%；羊、豬、雞、馬、鹿、鴿子、海鷗等動(dòng)物均可能為EHEC的攜帶者。EHEC的感染可形成直接傳播（動(dòng)物→人，人→人），也可以通過(guò)間接傳播（食物、水源→人）。食源性的EHEC感染中，牛肉、生奶、雞肉及其制品，蔬菜、水果及其制品等均可能受其污染。其中， 牛肉是最主要的傳播載體。

　　 EHEC O157:H7的感染劑量極低。潛伏期為3-10天，病程2-9天。通常是突然發(fā)生劇烈腹痛和水樣腹瀉，數天后出現出血性腹瀉，可發(fā)熱或不發(fā)熱。部分患者可發(fā)展為HUS、TTP等， 嚴重者可導致死亡。

　　   EHEC  O157:H7屬于腸桿菌科埃希氏菌屬。革蘭氏染色陰性，無(wú)芽胞，有鞭毛，動(dòng)力試驗呈陽(yáng)性。其鞭毛抗原可丟失，動(dòng)力試驗陰性，即O157:NM。EHEC O157:H7具有較強的耐酸性，pH2.5-3.0，37℃可耐受5小時(shí)；耐低溫，能在冰箱內長(cháng)期生存；在自然界的水中可存活數周至數月；不耐熱，75℃ 1分鐘即被滅活；對氯敏感，被1mg/L的余氯濃度殺滅。EHEC 的最適生長(cháng)溫度為33-42℃，37℃繁殖迅速，44-45℃生長(cháng)不良，45.5℃停止生長(cháng)。

　　   EHEC O157:H7除不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇外，其他常見(jiàn)的生化特征與大腸埃希氏菌基本相似，但也有某些生化反應不完全一致，具有鑒別意義（詳見(jiàn)表2）。EHEC O157:H7雖然有uidA基因，但其編碼的β-葡萄糖醛酸酶無(wú)活性，不能分解4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）產(chǎn)生熒光，即MUG陰性。

　　   EHEC除其代表菌株O157:H7外，還包括O157:NM、O26:H11、O111:H8、O125:NM、O121:H19、O45:H2、O4:NM、O145:NM、O5:NM、O91:H21、O103:H2、O113:H2等血清型的部分菌株。血清學(xué)鑒定包括O抗原和H抗原的鑒定。前者可使用玻片凝集試驗或膠乳凝集試驗；后者則應先進(jìn)行動(dòng)力試驗，動(dòng)力活潑者再進(jìn)行玻片和試管凝集試驗。

　　   EHEC O157:H7的另一個(gè)顯著(zhù)特征是可產(chǎn)生大量的Vero毒素（VT），也稱(chēng)作類(lèi)志賀氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子。Vero毒素按免疫原性等方面的不同可分為VT1和VT2。該毒素有一個(gè)A亞單位和5~6個(gè)B亞單位組成。B亞單位與宿主腸壁細胞糖脂受體結合，具有毒素活性的A亞單位進(jìn)入細胞，改變60s核糖體的組分，干擾蛋白質(zhì)的合成。編碼VT的基因位于噬菌體上，可缺失而不產(chǎn)生VT。

       1、培養基制備：

　　   改良EC新生霉素增菌肉湯 （mEC）

　　   EC肉湯滅菌后添加20mg/mL過(guò)濾除菌的新生霉素，使終濃度為20μg/mL。

　　   改良山梨醇麥康凱瓊脂（TC-SMAC）

　　   山梨醇麥康凱瓊脂加入過(guò)濾除菌的1%亞碲酸鉀溶液，使終濃度2.5mg/L，頭孢克污，使終濃度為0.05mg/L。

　　   MUG-LST肉湯

　　   LST肉湯中添加4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG），使終濃度為0.1g/L。

       2、增菌培養

　　   秤取25克樣品放入225mL mEC中，均質(zhì)。于41±1℃培養18-24小時(shí)。

       3、分離

　　   將mEC肉湯培養物10倍遞增稀釋。從10-4，10-5，10-6稀釋度，各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于36±1℃培養18~24小時(shí)�？梢� EHEC O157:H7菌落扁平，透明或半透明，邊緣光滑，呈淡褐色中心，直徑約2mm。

       4、鑒定

　　   挑取TC-SMAC上的可疑菌落，接種MUG-LST，于36±1℃培養18~24小時(shí)，出現產(chǎn)氣，且無(wú)熒光者，分離到普通營(yíng)養瓊脂。

　　   對純菌落用EHEC O157:H7標準血清或膠乳凝集試劑作凝集試驗，必要時(shí)進(jìn)行生化試驗。

　     在檢測過(guò)程中，也可以在選擇性增菌后，取出5mL增菌液，經(jīng)100℃水浴15分鐘滅活后，供自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫測試（VIDAS），迅速獲得初步結果，陽(yáng)性反應者需作進(jìn)一步證實(shí)。

　　   EHEC O157:H7檢驗程序圖解

檢樣25g

↓

　　　　　　mEC225mL → VIDAS快速篩選

　　↓41±1℃，18-24h

10^-4，10^-5，10^-6稀釋度涂布TC-SMAC

↓36±1℃，18-24h

挑取5-10個(gè)可疑菌落接種MUG-LST

↓36±1℃，18-24h

MUG陰性培養物轉種普通營(yíng)養瓊脂

↓ 　　　　↓

生化反應鑒定 　　　血清凝集鑒定

　　　　　　　或

　　　　　　　　　膠乳凝集試驗

　　  用上述方法在樣品中分離獲得的純菌落，經(jīng)抗E.coli O157:H7標準血清或EHEC O157:H7膠乳凝集測試為陽(yáng)性者，報告檢出腸出血性大腸桿菌O157:H7。

　　   如需要進(jìn)一步檢測Vero毒素基因的存在，可通過(guò)接種Vero細胞或Hela細胞，觀(guān)察細胞病變進(jìn)行判定，或可使用基因探針檢測和聚合酶鏈反應（PCR）檢測法。（參見(jiàn)FDA細菌分析手冊第8版）

表1：EHEC O157:H7部分生化反應特性

 

靛基質(zhì)（吲哚）試驗	陽(yáng)性
MR-VP試驗	MR陽(yáng)性 VP陰性
枸櫞酸鹽利用試驗	陰性
氧化酶試驗	陰性
三糖鐵瓊脂	底及斜面黃色，H2S-
纖維二糖發(fā)酵	陰性
山梨醇發(fā)酵	陰性或遲緩發(fā)酵
賴(lài)氨酸脫羧酶	陽(yáng)性（紫色）
鳥(niǎo)氨酸脫羧酶	陽(yáng)性（紫色）
棉子糖發(fā)酵	陽(yáng)性
衛矛醇發(fā)酵	陽(yáng)性
西蒙氏檸檬酸鹽	陰性
鼠李糖發(fā)酵	陽(yáng)性
MUG試驗	陰性
動(dòng)力試驗	有動(dòng)力或無(wú)動(dòng)力

　

表2： EHEC O157:H7與大腸埃希氏菌有鑒別意義的生化特性

試驗項目	E.coliO157:H7 （174株）%	大腸埃希氏菌
		（974株）%	（1887株）%
MUG	0	96	NT
山梨醇	0	95	80
棉子糖	100	20	49
衛矛醇	100	50	49
賴(lài)氨酸	100	92	81
鳥(niǎo)氨酸	100	74	58

                    [注] NT為未檢測，表內數字為陽(yáng)性率。

　　   適宜的蒸煮，適當的儲存溫度，個(gè)人衛生教育，防止糞便污染動(dòng)物胴體是控制出血性大腸桿菌污染的主要措施