1范圍
SN / T 1933 的本部分規定了食品和水中腸球菌平板計數、最近似值測定的檢驗方法。本部分適用于生活用水、生產(chǎn)加工用水及食品中腸球菌的檢驗。
2 規范性引用文件
下列文件中的條款通過(guò)SN / T 1933 的本部分的引用而成為本部分的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本部分，然而，鼓勵根據本部分達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本部分。
GB / T 6682 分析實(shí)驗室用水規格和實(shí)驗方法
SN / T 0330 出口食品中微生物學(xué)檢驗通則
3 術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)
3 .1術(shù)語(yǔ)和定義
下列術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)適用于SN / T 1933 的本部分。
腸球菌Enterococci
一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性球菌，兼性厭氧，無(wú)芽胞和莢膜，可分解膽汁七葉苷。是評估食品、水、食品加工設備、食品生產(chǎn)環(huán)境等衛生狀況的指標菌之一。
3 . 2 略縮語(yǔ)
3 . 2 . 1 BEA
膽汁七葉苷瓊脂。
3 . 2 . 2 BHIB
腦心浸液肉湯。
3 . 2 . 3 BHIA
腦心浸液瓊脂。
4 設備和材料
4.1電子天平：感量為0．001g 。
4.2恒溫水浴箱：46 ℃ 士1 ℃ 。
4.3恒溫培養箱：35℃士0.5℃，36℃士1℃，45℃ 士0.5℃，35℃士2℃ 。
4.4均質(zhì)器。
4.5振蕩器。
4.6移液管：容量1mL,10mL。
4.7培養皿。
5 培養基和試劑
實(shí)驗用水符合GB / T 6682 分析實(shí)驗室用水規格和實(shí)驗方法的要求。除另有規定外，試劑為分析純。
5 . 1疊氮化鈉葡萄糖肉湯（見(jiàn)附錄第A(yíng).l章）。
5 . 2 腸球菌肉湯（見(jiàn)附錄第A(yíng) . 2 章）。
5 . 3 KF 鏈球菌瓊脂（見(jiàn)附錄第A(yíng) . 3 章）。
5 . 4 腸球菌瓊脂（膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂）（見(jiàn)附錄第A(yíng) . 4 章）
5 . 5 膽汁七葉苷瓊脂（BEA 瓊脂）（見(jiàn)附錄第A(yíng) . 5 章）
5 . 6 腦心浸液肉湯（見(jiàn)附錄第A(yíng) . 6 章）。
5 . 7 含6 . 5 ％氯化鈉（NaCl）腦心浸液肉湯（見(jiàn)附錄第A(yíng) . 7 章）。
5 . 8 腦心浸液瓊脂（見(jiàn)附錄第A(yíng) . 8 章）。
5 . 9 緩沖蛋白胨水（見(jiàn)附錄第A(yíng)．9 章）。
6 樣品制備
6 . 1抽樣數量及抽樣方法
抽樣數量及抽樣方法按SN / T 0330 進(jìn)行。
6 . 2 樣品的貯存和運送
采樣后應盡快進(jìn)行檢驗，冷凍樣品如不能立即進(jìn)行檢驗，應置于-18 ℃ 保存。應冷藏保存的待檢樣品在運送實(shí)驗室過(guò)程中應于1 ℃ ~ -4 ℃ 保存。樣品采集后8h 之內要完成檢驗。
6 . 3制樣
6 . 3 .1水及液體飲料：污染程度低的水及液體飲料可以直接進(jìn)行檢驗；污染程度嚴重的水及液體飲料吸取25 mL 樣品，加人225 mL 緩沖蛋白胨水中，充分混勻，制成1：10 樣品勻液。
6 . 3 . 2 固體或半固體食品：無(wú)菌操作取25g樣品放人裝有225 mL 緩沖蛋白胨水的均質(zhì)杯內，以8000r/min均質(zhì)1min~2 min ，制成1 : 10 樣品勻液。
6 . 3 . 3 以上樣品制備可根據樣品污染程度及檢驗需要，進(jìn)一步制成功倍遞增的樣品稀釋液。
7 檢驗程序
食品和水中腸球菌平板計數法檢驗程序見(jiàn)圖1 。
25g (mL) + 225 mL 緩沖蛋白胨水
↓
10 倍梯度稀釋
↓
選擇2 個(gè)~3 個(gè)適宜連續稀釋度，各取1 mL 分別加入滅菌培養皿
↙ ↘
KF瓊脂36℃ 士1℃ 48h 士2h 腸球菌瓊脂35℃士2℃ 24h士2h
↘ ↙
確證實(shí)驗
↓
腸球菌陽(yáng)性
↓
菌落計數及計算
↓
報告結果
食品和水中腸球菌最近似值（MPN ）測定法檢驗程序見(jiàn)圖2 。
25g（mL ) + 225 mL 緩沖蛋白胨水
↓
10 倍梯度稀釋
↓
選擇3 個(gè)適宜連續稀釋度，各取1 ml 分別加入肉湯中
↙ ↘
疊氮化鈉葡萄糖肉湯管 腸球菌肉湯管
37℃ 士1℃ , 24h~48h 35C 士2 ℃ 24h 士2h
↓ ↓ ↓ ↓
無(wú)混濁 混濁 變黑 不變黑
↓ ↓ ↓ ↓
腸球菌陰性 確證實(shí)驗 確證實(shí)驗 腸球菌陰性
↓ ↓
腸球菌陽(yáng)性 腸球菌陽(yáng)性
↘ ↙
MPN 值法報告腸球菌數／g(mI)
圖2 食品和水中腸球菌最近似值（MPN）法的檢驗程序示意圖
8 檢驗步驟與計數
8 .1平板計數法
8 .1．1 適用范圍
此方法適用于檢驗未經(jīng)加工處理的生鮮食品及腸球菌菌數大于10 CFU / g ( mL ）的水和食品。
8 . 1 . 2 培養基制備
制備KF 瓊脂培養基或腸球菌瓊脂（膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂）（參見(jiàn)第A(yíng) . 3 章或第A(yíng) . 4 章），傾注平板前將融化的培養基于46 ℃ 士1℃ 水浴保溫。
8 .1．3 接種和培養
8 . 1 . 3 . 1 根據樣品污染情況，選擇2 個(gè)~ 3 個(gè)適宜連續稀釋度的樣液，分別吸取1mL 稀釋液，加人培養皿中，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平板。
8 .1．3 . 2 稀釋液加人培養皿后，把保持46℃士l℃的KF瓊脂或腸球菌瓊脂15ml傾人培養皿內，使樣液與培養基充分混合。水平放置，使瓊脂凝固。從制備最初稀釋液結束到傾注培養基于最后一個(gè)培養皿所用時(shí)間不應超過(guò)20min。倒置平板進(jìn)行培養，KF平板置36℃士l℃培養銘48h 士2h；腸球菌瓊脂平板置35 ℃士2℃培養24h士2h 。
8 .1．4 菌落形態(tài)觀(guān)察
腸球菌屬細菌在KF 平板上形成暗紅至粉紅色菌落，邊緣整齊；在腸球菌瓊脂平板上形成帶棕色環(huán)的棕黑色菌落。用滅菌接種針從每個(gè)KF 平板或腸球菌瓊脂平板挑取10個(gè)典型菌落，進(jìn)一步做確證實(shí)驗。
8 .1．5 確證實(shí)驗
典型菌落分別接種到BHIB 肉湯和BHIA 斜面，BHIB 肉湯置35℃士0．5℃ 培養24h 士2h , BHIA 斜面置35℃士0 . 5℃ 培養48h士2h 。
8 .1．5 . 1 BHIB 肉湯培養24h 后，每管肉湯培養物分別接種到相應BEA 平板、BHIB 肉湯及含6 . 5 %氯化鈉（NaCI）的BHIB 肉湯中。BEA 平板及含6 . 5 ％氯化鈉（NaCI）的BHIB 肉湯置35℃士0 . 5℃ 培養48h 士2h ; BHIB 肉湯置45 ℃ 士0 . 5 ℃ 培養48h 士2h ，觀(guān)察細菌生長(cháng)情況。
8 .1．5 . 2 BHIA 斜面培養48h 后，從斜面上挑取菌落作革蘭氏染色。
8 . 1 . 5 . 3 革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性球菌；在BEA 平板上生長(cháng)并水解七葉苷（形成黑色或棕色沉淀）; BHIB 肉湯中45 ℃ 士0．5 ℃ 生長(cháng)；并且在含6 . 5 ％氯化鈉（NaCI）的BHIB 肉湯中35℃士0 . 5℃生長(cháng)良好；具有以上特性的典型菌落可確證為腸球菌。
8 .1．6 菌落計數
對確證為腸球菌的菌落進(jìn)行平板計數，生長(cháng)有30 個(gè)~300 個(gè)腸球菌為計數合適范圍。
8.1．7 結果計算
8 . 1 . 7 . 1 用所選擇計數的每個(gè)平板上典型腸球菌的菌落數，乘以確認為腸球菌的菌落所占比例，以此求出所選取的同一稀釋度兩個(gè)計數平板的腸球菌菌落數。
示例：10-1稀釋樣液的兩個(gè)平板上分別有85 個(gè)和90 個(gè)菌落，每個(gè)平板所挑取的功個(gè)典型菌落中，確認為腸球菌的分別有8 個(gè)和9 個(gè)，則此稀釋度的兩個(gè)計數平板上腸球菌菌落數分別是85 x（8 / 10 ）=68 及90x（9 / 10 ）=81 。
8 .1．7 . 2 若只有一個(gè)稀釋度平板上的腸球菌菌落數在計數合適范圍30 個(gè)~300 個(gè)之間，則計算兩個(gè)平板菌落數的平均值，再將平均值除以相應稀釋倍數，作為每克（毫升）中菌落總數結果。
8.1．7 . 3 若有兩個(gè)連續稀釋度在適宜計數范圍內時(shí)，按式(1)計算：
N=∑C/[(n1+0.1n2)d]………………………………………………… （l)
式中：
N ― 樣品中腸球菌菌落數；
∑C ― 兩個(gè)連續稀釋度平板（含適宜范圍菌落數的平板）腸球菌菌落數之和
n1 ― 適宜范圍菌落數的第一稀釋度（低）平板個(gè)數；
n2 ― 適宜范圍菌落數的第二稀釋度（高）平板個(gè)數；
d ― 第一稀釋度的稀釋倍數。
示例：
|
稀釋度 |
1:10（第一稀釋度） |
1:100（第二稀釋度） |
|
菌落數 |
245,247 |
31,30 |
N=∑C/[(n1+0.1n2)d] =( 245 + 247 + 31 + 30 )/[(2 + 0.1x2）x10-1]=2514
上述數據經(jīng)修約后，結果表述為2 .5x103 CFU/g(mL）。
8 . 1 . 7 . 4 若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無(wú)特征性菌落生長(cháng)，則以小于l/d(d一最低稀釋倍數）計算。
8 . 1 . 7 . 5 低數值的估算：如果實(shí)驗樣品原液（水及液體飲料）或初始稀釋?xiě)乙海ㄆ渌称罚┑膬蓚�(gè)瓊脂平板上的菌落數均小于30 個(gè)，計算兩個(gè)瓊脂平板上菌落數的算術(shù)平均數。計算方法見(jiàn)式（2 ) :
NE=∑C /nd…………………………………( 2 )
式中：
NE ― 每毫升或每克樣品中腸球菌數的估算值；
∑C ― 兩個(gè)瓊脂平板上腸球菌菌落數的和；
n― 瓊脂平板的數量；
d ― 樣品初始懸液或實(shí)際接種懸液的稀釋倍數。
8 . 1 . 7 . 6 大數值的估算：若所有稀釋度的平板上菌落數均大于300 ，計數最接近300 個(gè)菌落數的瓊脂平板上的菌落并計算出算術(shù)平均數。其他平板可記錄為多不可計。
結果計算見(jiàn)式（3 ) :
NF=∑C /nd……………………………………………… （3 )
式中：
NF ― 每毫升或每克樣品中腸球菌菌落數的估計值；
∑C ― 兩個(gè)瓊脂平板上腸球菌菌落數之和；
n― 瓊脂平板的數量；
d ― 與樣品懸液相一致的稀釋倍數。
8 . 1 . 8 結果表述方式
8 .1．8 . 1 菌落數在100 以?xún)葧r(shí)，按有效數字修約規則修約，采用兩位有效數字報告。
8 .1．8 . 2 菌落數大于或等于100 時(shí)，前第3 位數字采用有效數字修約規則修約后，取前2 位數字，后面用。代替位數來(lái)表示結果；也可用10 的指數形式來(lái)表示，此時(shí)也按有效數字修約規則修約，采用兩位有效數字。
8 . 1 . 9 結果報告
固體樣品以CFU/g為單位報告，液體樣品以CFU/ml才為單位報告。
8 . 2 最近似值（MPN）測定法
8 . 2 . 1 適用范圍
此方法適用于污染程度低的樣品，檢驗含有受損傷的腸球菌的加工食品及腸球菌菌數小于等于10 CFU/g(ml）的水和食品。
8 . 2 . 2 接種
根據樣品污染情況，選擇3 個(gè)適宜連續稀釋度的樣液，分別吸取1 mL 稀釋液，接種于疊氮化鈉葡萄糖肉湯或腸球菌肉湯，每個(gè)稀釋度加3 管。接種量為1 ml 時(shí)，使用功ml單料管；對于低污染樣品，將10 mL最低稀釋度的樣品液加到等體積的雙料培養基中。
8 . 2 . 3 培養
接種后的腸球菌肉湯置35℃士2℃ 培養24h 士2h ，肉湯顏色變?yōu)楹谏脑嚬�，表明有腸球菌生長(cháng)。一般有腸球菌生長(cháng)時(shí)，肉湯顏色在2h 內即可變?yōu)楹谏?BR>接種后的疊氮化鈉葡萄糖肉湯置36℃士1℃ 培養24h士2h，檢查各試管混濁情況。若無(wú)混濁，繼續培養至48h 士2h 后記錄結果。
8 . 2 . 4 確證試驗
8 . 2 . 4 . 1 對所有呈現混濁的疊氮化鈉葡萄糖肉湯管或顏色變?yōu)楹谏哪c球菌肉湯管進(jìn)行確證試驗。用接種環(huán)將各管的培養物劃線(xiàn)接種于KF 平板或腸球菌瓊脂平板。KF 平板置36℃士1℃ 培養48h士2h；腸球菌瓊脂平板置35℃士2 ℃ 培養24h 士2h 。
8 . 2 . 4 . 2 腸球菌屬細菌在KF 平板上形成暗紅至粉紅色菌落，邊緣整齊；在腸球菌瓊脂平板上形成帶棕色環(huán)的棕黑色菌落。用滅菌接種針從KF 平板或腸球菌瓊脂平板挑取10 個(gè)可疑菌落，按8 . 1 . 5 所述進(jìn)行確證試驗。
8 . 2 . 5 最近似值MPN
8 . 2 . 5 . 1 如一管培養物中所挑取的典型菌落中，有一個(gè)菌落確認為腸球菌，則該管應視為陽(yáng)性。
8 . 2 . 5 . 2 根據接種的樣品量和確證為腸球菌的陽(yáng)性反應管數，查MPN 值表（參見(jiàn)附錄B) ，得出樣品中腸球菌最近似值。
8 . 2 . 6 結果報告
腸球菌MPN/g(mL）。
附錄A （資料性附錄）培養基
A . 1 疊氮化鈉葡萄糖肉湯
A . 1 . 1 成分
牛肉浸膏 4.5g
胰蛋白脈15.0g
葡萄糖7.5g
氯化鈉7.5g
疊氮化鈉0.2g
蒸餾水1000.0mL
A . 1 . 2 制法
將上述各成分混勻，不斷攪拌加熱溶解。每管分裝10 mL , 121 ℃ 高壓滅菌15 min，調節pH至7.2。若制備雙料濃度的疊氮化鈉葡萄糖肉湯，可將上述配方蒸餾水改為500ml。
A . 2 腸球菌肉湯
A . 2 . 1成分
胰蛋白胨17.0g
牛肉浸膏3.0g
酵母浸膏5.0g
牛膽粉10.0g
氯化鈉5.0g
檸檬酸鈉1.0g
七葉苷1.0g
檸檬酸鐵銨0.5g
疊氮化鈉0.25g
蒸餾水1000.0ml
2 制法
將上述各成分加熱煮沸溶解冷卻后，調pH至7.1 士0.2，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。
A . 3 KF 鏈球菌瓊脂
A . 3 . 1 成分蛋白脈酵母浸膏氯化鈉甘油磷酸鈉麥芽糖乳糖瓊脂
蛋白胨 10.0g
酵母浸膏10.0g
氯化鈉 5.0g
甘油磷酸鈉10.0g
麥芽糖20.0g
乳糖1.0g
疊氮化鈉0.4g
瓊脂20.0g
蒸餾水1000.0ml
A . 3 . 2 制法
將各成分加熱溶解，用10％的碳酸鈉調整pH 值至7.2,121℃高壓滅菌15 min ，冷卻至50℃ ~ 60℃時(shí)加人無(wú)菌1 ％氯化三苯四氮唑水溶液10 mL 。
A . 4 腸球菌瓊脂（膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂）
A . 4 . 1 成分
胰蛋白胨17.0g
牛肉浸膏3.0g
酵母浸膏5.0g
牛膽粉10.0g
氯化鈉5.0g
檸檬酸鈉1.0g
七葉苷1.0g
檸檬酸鐵銨0.5g
疊氮化鈉0.25g
瓊脂13.5g
蒸餾水1000.0ml
A . 4 . 2 制法
121 ℃ 高壓滅菌15 min ，滅菌后調節pH 至7 . 1 ，于45℃ ~50 ℃ 保溫培養基，從保溫開(kāi)始至傾注平板的時(shí)間不要超過(guò)4h 。
A . 5 膽汁七葉苷瓊脂
A . 5 . 1 成分
蛋白胨8.0g
膽鹽20.0g
檸檬酸鐵0.5g
七葉苷1.0g
瓊脂15.0g
蒸餾水1000.0ml
A . 5 . 2 制法
將各成分加熱溶解, 121 ℃ 高壓滅菌15 min ，調節pH 至7 . 1 士0 . 2 。冷至45 ℃~50 ℃ 傾注平板。
A . 6 腦心浸液肉湯（BHIB)
A . 6 . 1 成分
牛腦浸出粉10.0g
牛心浸出粉9.0g
胰蛋白胨10.0g
葡萄糖2.0g
氯化鈉5.0g
磷酸氫二鈉2.5g
A . 6 . 2 制法
將各成分加人蒸餾水中，加熱溶解，調節pH 至7.4士0 .2，分裝，121℃高壓滅菌15min。
A . 7 含6.5 ％氯化鈉（NaCl）腦心浸液肉湯
A . 7 . 1 成分
除加人氯化鈉（NaCl)，其余成分與BHIB相同。
A . 7 . 2 制法
每升BHIB中加60.0g 氯化鈉（NaCl) ，其余制法與BHIB 相同。
A . 8 腦心浸液瓊脂
A . 8 . 1 成分
除每升BHIB 加15.0g瓊脂，其余成分與BHIB 相同。
A . 8 . 2 制法
稱(chēng)取52g 無(wú)水BHIA 溶于1 000 mL 蒸餾水中，加熱溶解，每管分裝10mL ,121℃高壓滅菌15min，制備成斜面，調節pH至7.4士0.2 。
A . 9 緩沖蛋白胨水
A . 9 . 1 成分
蛋白胨10.0g
氯化鈉5.0g
磷酸氫二鈉9.0g
磷酸二氫鉀1.5g
蒸餾水1000.0ml
A . 9 . 2 制法
按上述成分配好后，調節pH 至7.2 ，每瓶分裝225ml , 121℃ 高壓滅菌15min 。
附錄B
（規范性附錄）
1g樣品中最近似值（MPN ）表
表B .1 1.0g品中最近似值（MPN）表
|
陽(yáng)性管數／（g/mL ) |
MPN |
陽(yáng)性管數／(g/mL ) |
MPN |
|
0.1 0.01 0.001 |
0.1 0.01 0.001 |
|
0 0 0
0 0 1
0 0 2
0 0 3
0 1 0
0 1 1
0 1 2
0 1 3
0 2 0
0 2 1
0 2 2
0 2 3
0 3 0
0 3 1
0 3 2
0 3 3 |
<3
3
6
9
3
6.1
9.2
12
6.2
9.3
12
16
9.4
13
16
19 |
2 0 0
2 0 1
2 0 2
2 0 3
2 1 0
2 1 1
2 1 2
2 1 3
2 2 0
2 2 1
2 2 2
2 2 3
2 3 0
2 3 1
2 3 2
2 3 3 |
9.1
14
20
26
15
20
27
34
21
28
35
42
29
36
44
53 |
|
1 0 0
1 0 1
1 0 2
1 0 3
1 1 0
1 1 1
1 1 2
1 1 3
1 2 0
1 2 1
1 2 2
1 2 3
1 3 0
1 3 1
1 3 2
1 3 3 |
3.6
7.2
11
15
7.3
11
15
19
11
15
20
24
16
20
24
29 |
3 0 0
3 0 1
3 0 2
3 0 3
3 1 0
3 1 1
3 1 2
3 1 3
3 2 0
3 2 1
3 2 2
3 2 3
3 3 0
3 3 1
3 3 2
3 3 3 |
23
39
64
95
43
75
120
160
93
150
230
290
240
640
1100
>1100 |
|
注：表內所列樣品量如改為1g（ml）,0.1g(ml),0.01g(ml)時(shí)，表內數字應相應降低10倍；如改為0.01g（ml）,0.001g(ml)0.0001g(ml)時(shí)，則表內數字相應增加10倍，其余可類(lèi)推。 |
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