食品和水中腸球菌檢驗方法第2 部分：濾膜法

 

1范圍

SN /T 1933 的本部分規定了水和液體飲料中腸球菌檢驗濾膜法。
本部分適用于生活用水、生產(chǎn)加工用水、廢水及茶飲料、碳酸飲料等液體飲料中腸球菌的檢驗。

2 規范性引用文件

下列文件中的條款通過(guò)SN / T 1933 的本部分的引用而成為本部分的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本部分，然而，鼓勵根據本部分達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本部分。
GB / T 6682 分析實(shí)驗室用水規格和實(shí)驗方法
SN / T 0330出口食品中微生物學(xué)檢驗通則

3 方法提要

一定數量液體樣品或樣品稀釋液通過(guò)濾膜時(shí)，細菌被截留在濾膜上。將濾膜置于選擇性培養基上培養后，腸球菌菌落呈現特定顏色。經(jīng)過(guò)腸球菌菌落確證實(shí)驗后，計數并計算濾膜上陽(yáng)性腸球菌菌落數，即可檢驗出樣品中腸球菌數目。

4 術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)

SN / T 1933 . 1 確立的術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)適用于SN / T 1933 的本部分。

5 設備和材料

5 .1電子天平：感量為0.001g 。
5 . 2 恒溫培養箱：41℃士0 .5℃，35℃士0.5℃，45℃士0.5℃

5 . 3 振蕩器。
5 . 4 移液管：容量1mL ,10mL 。
5 . 5 培養皿：9x50 mm ，直徑90 mm 。
5 . 6 玻璃、耐高溫塑料、陶瓷或不銹鋼過(guò)濾器。
5 . 7 抽濾瓶。
5 . 8 真空泵。
5 . 9 濾膜：直徑47mm ，微孔徑0.45um 士0.02um 。

6 培養基和試劑

實(shí)驗用水符合GB / T 6682 分析實(shí)驗室用水規格和實(shí)驗方法的要求。除另有規定外，試劑為分析純。

6.1 mEI 瓊脂（見(jiàn)第A(yíng) . l 章）。
6 . 2 膽汁七葉苷瓊脂（BEA 瓊脂）（見(jiàn)第A(yíng) . 2 章）。

6 . 3腦心浸液肉湯（見(jiàn)第A(yíng) . 3 章）。

6 . 4含6 . 5 % NaCl 腦心浸液肉湯（見(jiàn)第A(yíng) . 4 章）。

6 . 5腦心浸液瓊脂（見(jiàn)第A(yíng) . 5 章）。

6 . 6緩沖蛋白胨水（見(jiàn)第A(yíng) . 6 章）。

7 樣品制備

7 .1抽樣數量及抽樣方法
抽樣數量及抽樣方法按SN / T 0330 進(jìn)行。
7 . 2 樣品的貯存和運送
采樣后應盡快進(jìn)行檢驗，冷凍樣品如不能立即進(jìn)行檢驗，應置于-18 ℃ 保存。應冷藏保存的待檢樣品在運送實(shí)驗室過(guò)程中應于l ℃ ~ 4 ℃ 保存。樣品采集后8h 之內要完成檢驗。
7 . 3 制樣
7 . 3 . 1 污染程度低的水及液體飲料可以直接進(jìn)行檢驗。
7 . 3 . 2 污染嚴重的水及液體飲料可吸取25 mL 樣品，加人225 mL 緩沖蛋白胨水中，充分混勻，制成l：10樣品勻液。
7 . 3 . 3 以上樣品制備可根據樣品污染程度及檢驗需要，進(jìn)一步制成10 倍遞增的樣品稀釋液。

8 檢驗程序

水和液體飲料中腸球菌濾膜法檢驗程序見(jiàn)圖l 。

樣品原液或適當倍數稀釋液

↓

樣品過(guò)濾

↓

mEl 瓊脂4l℃ 士0.5℃ 24h 士lh

↓

取帶藍色暈輪的菌落進(jìn)行確證實(shí)驗

↙                 ↙                ↘            ↘

                   革蘭氏陽(yáng)性球菌     BEA平板生長(cháng)，  在BHIB中45℃生長(cháng)    6.5%NaCl的BHIB

                                         水解七葉苷                           中35℃ 生長(cháng)

↓

腸球菌陽(yáng)性

↓

菌落計數及計算

↓

報告結果

圖1 食品和水中腸球菌濾膜法的檢驗程序示意圖

9 檢驗步驟與計數

9 .1培養基平板制備
制備mEI 瓊脂培養基（見(jiàn)第A(yíng) . 1 章）。
9 . 2 樣品量的選擇
根據樣品污染情況，選擇適宜稀釋度的樣液。樣品加樣量在1mL ~100 mL 之間按半對數間距選擇（例如：加樣100ml 、30ml、10ml、3ml)，以能在濾膜上生長(cháng)出20 個(gè)~60 個(gè)菌落為宜。每個(gè)樣品至少選擇三個(gè)加樣量進(jìn)行過(guò)濾。
9 . 3 樣品過(guò)濾
將滅過(guò)菌的過(guò)濾裝置連接到抽濾瓶上，用無(wú)菌鑷子夾取濾膜，將濾膜放至濾器底部。無(wú)菌吸取樣液至濾器內，打開(kāi)真空泵進(jìn)行抽濾。當全部樣液通過(guò)濾膜后，用20mL~30ml滅菌生理鹽水輕洗濾器邊緣至少兩次。關(guān)閉真空泵，打開(kāi)濾器，用無(wú)菌鑷子移取濾膜。
9 . 4 接種與培養
將已濾過(guò)樣液的濾膜緊貼在mEI瓊脂表面上，防止濾膜與瓊脂間產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生，重新放置濾膜。倒置平板于41℃ 士0.5℃ 培養24h 士lh 。
9 . 5 菌落形態(tài)觀(guān)察
腸球菌在mEI 瓊脂平板的濾膜上形成帶有藍色暈輪的菌落。
9 . 6 確證試驗
9 . 6 . 1 用滅菌接種針從濾膜上至少挑取10 個(gè)帶有藍色暈輪的菌落（不必考慮菌落本身顏色，只要是帶有藍色暈輪的菌落即可）進(jìn)行確證試驗。菌落分別接種到BHIB 肉湯和BHIA 斜面，BHIB 肉湯置35℃士0.5℃ 培養24h士lh , BHIA 斜面置35℃士0.5℃ 培養48h士lh 。
9 . 6 . 2 BHIB 肉湯培養24h士lh 后，每管肉湯培養物分別接種到相應BEA 平板、BHIB 肉湯及含6.5％氯化鈉的BHIB 肉湯中。BEA 平板及含6.5％氯化鈉的BHIB 肉湯置35℃士0. 5℃培養48h士lh ; BHIB 肉湯置45℃士0.5℃培養48h士lh，觀(guān)察細菌生長(cháng)情況。
9 . 6 . 3 BHIA 斜面培養48h士lh后，從斜面上挑取菌落作革蘭氏染色。
9 . 6 . 4 革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性球菌；在BEA 平板上生長(cháng)并水解七葉苷（形成黑色或棕色沉淀）; BHIB 肉湯中45 ℃ 士0.5 ℃ 生長(cháng)；并且在含6 . 5 ％氯化鈉的BHIB 肉湯中35℃ 士0．5℃生長(cháng)良好；具有以上特性的典型菌落可確證為腸球菌。
9 . 7 腸球菌的計數
對確證為腸球菌菌落的濾膜進(jìn)行計數，生長(cháng)有20 個(gè)~60 個(gè)腸球菌的濾膜為計數合適范圍。

9 . 8 腸球菌菌數的計算
根據所使用的樣品量，按照式（1)，計算每100 mL 樣品中腸球菌菌落數。

腸球菌／100 ml =腸球菌菌落數x100 /[樣品過(guò)濾體積（mL）x稀釋倍數]

10 結果報告

腸球菌：CFU/100ml 。

附錄A

（資料性附錄）

培養基

A . 1 mEI 瓊脂

A . 1 . 1 成分
蛋白胨10.0g
氯化鈉15.0g
七葉苷1.0g
放線(xiàn)菌酮0.05g
疊氮化鈉0.15g
酵母浸膏30.0g
β-D- 引哚葡糖苷0.75g
瓊脂15.0g
蒸餾水100O.0ml
A . 1 . 2 制法
將以上各成分加熱溶解，121 ℃ 高壓滅菌15min ，在50 ℃ 水浴中冷卻。在5 ml蒸餾水中加0.24g萘啶酮酸，滴加幾滴0 .1 mol/L的氫氧化鈉，配制萘啶酮酸溶液，將此溶液加人mEI瓊脂中。再加人0 . 02g無(wú)菌氯化三苯四氮唑（TTC ) ，充分混勻。調節pH 值至7.1 士0.2 。
傾注約4 mL~6mL的mEI瓊脂至9x50 mm 的平板，瓊脂厚度約4mm ~5mm。平板冷藏備用。

A . 2 膽汁七葉苷瓊脂

A . 2 . 1 成分
蛋白胨8.0g
膽汁鹽20.0g
檸檬酸鐵0.5g
七葉苷1.0g
瓊脂15.0g
蒸餾水1000.0ml
A . 2 . 2 制法

將各成分加熱溶解, 121 ℃ 高壓滅菌15 min ，調節pH 值至7 . 1 士0 . 2 。冷至45℃~50 ℃ 傾注平板。

A . 3 腦心浸液肉湯（BHIB )

A . 3 . 1 成分

牛腦浸出粉10.0g

牛心浸出粉9 .0g

胰蛋白胨10.0g

葡萄糖2 .0g

氯化鈉5 . 0g

磷酸氫二鈉2 . 5g

蒸餾水1000.0ml

A . 3 . 2 制法
將各成分加人蒸餾水中，加熱溶解，調節pH 至7 . 4 士0 . 2 ，分裝，121 ℃ 高壓滅菌15 min 。

A . 4 含6 . 5 ％氯化鈉（NaCl）腦心浸液肉湯
A . 4 . 1 成分
除加人氯化鈉（NaCl) ，其余成分與BHIB 肉湯相同。
A . 4 . 2 制法
每升BHIB 肉湯中加60.0g 氯化鈉（NaCl)，其余制法與BHIB 肉湯相同。
A . 5 腦心浸液瓊脂
A . 5 . 1 成分
除每升BHIB 肉湯加15 .0g 瓊脂，其余成分與BHIB 肉湯相同。
A . 5 . 2 制法
稱(chēng)取52g BHIA 溶于1000 mL 蒸餾水中，加熱溶解，每管分裝10 mL , 121 ℃ 高壓滅菌15min ，制備成斜面，調節pH 至7.4士0.2 。
A . 6 緩沖蛋白胨水

A . 6 . 1 成分
蛋白胨10 . 0g
氯化鈉5 . 0g
磷酸氫二鈉9 . 0g
磷酸二氫鉀1 . 5g
蒸餾水1000.0ml
A . 6 .2 制法
按上述成分配好后，調節pH 至7.2，每瓶分裝225 ml , 121 ℃ 高壓滅菌15min 。