鏈霉菌實(shí)驗操作6

（1）將干凈的膠板裝好，用瓊脂糖膠（至少1％濃度）封邊。

（2）配分離膠，配方如下：（1.5mm厚的膠需要10ml）

10%分離膠（5ml）：去離子水1.25ml，30%丙烯酰胺1.7ml，1M This-HCl（pH=8.8）1.95ml，10% SDS 50ul，10%過(guò)硫酸胺100ul，TEMED 2ul。（倒膠前才加入TEMED催化劑）

（3）用去離子水密封液面，左右輕輕搖擺使液面水平（聚丙烯酰胺的聚合不能接觸氧氣，所以用水封液面，水還能使聚丙烯酰胺的上液面保持平整。）

（4）室溫聚合或放溫箱中加速聚合，傾斜膠板吸出水，倒濃縮膠（1.5mm厚的膠需要3ml）。濃縮膠配方如下：

濃縮膠1ml：去離子水0.68ml，1M This-HCl（pH=6.8）0.13ml，30%丙烯酰胺0.17ml，10% SDS 10ul，10%過(guò)硫酸胺10ul，TEMED 1ul。（倒膠前才加入TEMED催化劑）

（5）插上梳子，等膠凝固后，拔掉梳子，如果膠孔里有很多氣泡，需要用濾紙剪成小條吸去氣泡。

（6）加入電泳緩沖液點(diǎn)樣電泳，蛋白在濃縮膠時(shí)可以用150V電壓，在分離膠時(shí)可以用250V電壓，注意觀(guān)察蛋白的濃縮效果，如果濃縮效果不好說(shuō)明電泳緩沖液或配膠時(shí)的緩沖液用的次數過(guò)多，或已經(jīng)不能用了，電泳緩沖液可用4-5次。

（7）電泳完畢后用染色液染膠至少1小時(shí)，脫色2至5小時(shí)（根據膠的厚度），其間換脫色液2-3次，可用水繼續脫色和短期保存膠，或制備干膠長(cháng)期保存。

 

試劑：

30%丙烯酰胺：29g丙烯酰胺，1g N,N’-亞甲雙丙烯酰胺，溫去離子水定容到100ml（請先在棕色瓶子上做好記號定容，丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺都有毒，要帶手套和口罩操作，不要污染量桶）

Tris-Gly電泳緩沖液（5倍，1L）：15.1g Tris，94g Glycine，pH8.3，50ml 10%SDS，去離子水定容。

10%過(guò)硫酸胺：0.5g過(guò)硫酸胺，去離子水定容到5ml。4度保存。（此物容易失活，最好每次少量配置。膠凝不了，凝的時(shí)間長(cháng)或凝得不充分多半是它的問(wèn)題。過(guò)硫酸胺在聚合反應過(guò)程中提供自由基。）

脫色液（0.5L）：50ml冰醋酸，225ml甲醇，225ml去離子水。（甲醇有毒）

（或50ml冰醋酸，235ml 95%乙醇，215ml去離子水。）（防止揮發(fā)，密閉保存。）

染色液：0.25%（染色效果不好就加大）的考馬斯亮藍溶于脫色液中。

 

可溶性蛋白的表達沒(méi)有固定的方法，對不同的蛋白會(huì )有不同的方法，如果抽出的可溶性蛋白不多，可用基本培養基代替LB，用30或25度培養代替37度，IPTG（誘導物）的量也可減少，誘導時(shí)間也可變化。下面的方法僅供參考:

1．  將菌接種于5ml LB（含抗生素）培養基中過(guò)夜培養，

2．  將過(guò)夜培養物全部接種到200ml含抗生素的 MM培養基中，37度培養4-5小時(shí)，加IPTG至終濃度0.5mM（可變），37度培養13小時(shí)。

3．  將細胞培養物用20mM的冰冷的Tris-HCl（pH=7.5）濃縮10倍，

4．  在冰上用超聲波處理（power lever為4-5，duty設為40－50％，60-120次脈沖，每30次脈沖后在冰中放30秒冷卻），

5．  4度10000rpm離心10分鐘,

6．  將上清通過(guò)0.45um的濾膜（細菌過(guò)濾器）

 

附：MM培養基（1L）

硫酸銨1g，磷酸氫二鉀0.5g，7水硫酸鎂0.2g，7水硫酸亞鐵0.1g

 

方法一：原生質(zhì)體法

用作鏈霉菌原生質(zhì)體的一般步驟作到用過(guò)濾器過(guò)濾那一步，后面的操作就和大腸桿菌一樣。

方法二：液氮法

1．  將搖好或從平板（鋪有玻璃紙）上刮下來(lái)的菌體放入已經(jīng)由液氮預冷了的拈砵中，加液

氮，用瓷棒將菌體磨成粉狀，其間可加一兩次液氮。（搖的菌體需先離心去掉培養基）

2．  將粉末收集到冰凍過(guò)的瓶子中（可-70度保存）

3．  直接加pH為7.4（或其他）的20mM Tris-HCl到一定體積

用大腸桿菌的方法加上樣液，煮菌體，上樣。（加上樣液之前后一定將菌體盡量打散，可防止菌體不能完全破裂，且加入1M的DTT至終濃度50mM防止加熱時(shí)二硫鍵的形成。）

 

誘導蛋白表達：

1．  取過(guò)夜培養物50ul-200ul接種于5ml含抗生素的Universal瓶中

2．  37度搖2小時(shí)左右

3．  取一定體積的菌液做陰性對照，其余的加IPTG至終濃度為0.2mM（可變）（4ml培養基加80mM的IPTG10ul）

4．  37度搖2小時(shí)左右

檢測蛋白表達：

5．  取100ul（或更多）培養物，用pH值為7.4的20mM Tris-HCl（或PBS 7.4）濃縮10倍或5倍。（菌體多時(shí)也可不濃縮）

6．  加等體積的2倍上樣液（Sampling Buffer），或1／9體積10倍上樣液。（加上樣液之前后最好將菌體盡量打散，可防止菌體不能完全破裂，還可加入1M的DTT至終濃度50mM防止加熱時(shí)二硫鍵的形成。）

7．  100度煮2-4分鐘

8．  12000rpm，離心1min（菌體破碎完全時(shí)也可不做）

9．  取上清點(diǎn)樣做SDS-PAGE

 

部分試劑：

1．  蛋白上樣buffer(2倍)（10ml）：

SDS 0.2g，溴酚藍0.0006g，1M Tris-HCl (pH=6.8) 0.8ml，glycerol 1.5ml。

2．  蛋白上樣buffer(10倍)（10ml）：

SDS 1g，1MTris-HCl (pH=6.8)2.5ml，溴酚藍0.003g，glycerol 4ml。

3．1M DTT（二硫蘇糖醇）

3.09g DTT溶于20ml 0.01mol／l 乙酸鈉，過(guò)濾除菌，分裝，-20度儲存。

 

1.         SDS-PAGE

2.         將膠切成所需的大小放入轉移緩沖液中15-60分鐘。（膠在不同的緩沖液中會(huì )有不同的大小，這一步能讓膠的大小達到平衡。0.7mm的膠只需平衡20分鐘左右，1.5mm的膠需平衡40分鐘）

3.         將電轉夾板平放在桌面上（先墊一層保鮮膜），依次在夾板的一面放上海綿，濾紙，膠（塑料片），膜，濾紙，海綿，關(guān)閉夾板。（所有的東西都要先用轉移緩沖液（transfer buffer）浸濕；膠和膜之間不能留有氣泡；需要用潔凈的玻璃棒從一側開(kāi)始把氣泡趕走；塑料片放在膠的旁邊；蛋白轉移一般用硝酸纖維素膜，光的一面朝向膠；濾紙的大小和海綿差不多，膜的大小比膠稍微大一點(diǎn)）

4.         將電轉夾板放入電轉槽中，有膠的一面朝向負極，電轉槽中可放入攪拌子，在電轉時(shí)攪拌可是緩沖液離子和溫度保持均一，電轉應在4度（冰箱中）進(jìn)行，可30V過(guò)夜電轉或70V電轉5小時(shí)。

5.         拆開(kāi)電轉夾板，將膜放入潔凈的培養皿（7cm）中，用麗春紅（Ponceau S）染液染色5分鐘，室溫，緩慢搖動(dòng)。用去離子水脫色數秒鐘，傾出去離子水，可以看見(jiàn)蛋白質(zhì)紅色的條帶。（此步可不做，染色并不是很清楚。）

6.         用TBS潤洗膜10分鐘，脫去麗春紅為止，如果沒(méi)做第五步，則只需稍微潤洗兩三次即可，去掉SDS和電轉緩沖液。

7.         倒掉所有的TBS，用封閉液（blocking solution）浸泡膜一小時(shí)，室溫（或4度，過(guò)夜），輕輕搖動(dòng)

8.         用TTBS將膜潤洗兩三次（不需停留）

9.         將膜泡入含一抗的封閉液中，室溫，輕搖2小時(shí)

10.     將一抗收集可在4度保存至少1-2周仍然有活性，（含有終濃度為0.02％的疊氮化鈉防腐）

11.     重復8

12.     用含二抗的封閉液孵育1小時(shí)，收集含二抗的封閉液同步驟10

13.     重復8

14.     加顯色液NBT-BCIP（10ml），暗處顯色，搖動(dòng)，5分鐘至數小時(shí)內可顯色好。

 

ponceau S Stain（麗春紅染液）：

1ml冰醋酸，0.5g Ponceau S，去離子水100ml

TBS：

150mM NaCl，25mM This-HCl （pH＝7.4）

TTBS：

0.5％ Tween-20 in TBS

封閉液（blocking buffer）（約2％）：

2.5g脫脂奶粉 用TBS定容到100ml，電爐上加熱（用大些的容器防止產(chǎn)生大量氣泡），冷卻，用玻棒刮去表面的油脂，再加熱冷卻數次，濾紙過(guò)濾，用去離子水定容到100ml。長(cháng)期保存需加疊氮化鈉至終濃度0.02％。

Transfer Buffer（電轉緩沖液）：

300ml甲醇，3.64g Tris Base，21.6g Glycine，去離子水定容到1.5L

 

電轉的容器需最后用去離子水漂洗。所有的操作都要戴手套，防止手上的油脂和蛋白污染膜，也避免SDS，甲醇等試劑沾到手上。用一個(gè)洗凈了的培養皿和保鮮膜做雜交和洗膜、顯色等操作。

硝酸纖維素膜使用浙江臺州的，0.45nm孔徑，130nm厚度

使用北京六一電泳儀器廠(chǎng)生產(chǎn)的電轉槽（40B）。

二抗用AP偶聯(lián)的羊抗小鼠或羊抗兔抗體，使用NBT／BCIP染色試劑盒進(jìn)行顯色（華美，NBS82112天源代理）

抗體的稀釋比例請參照產(chǎn)品說(shuō)明和經(jīng)驗。