鏈霉菌實(shí)驗操作5

   1. 在MS平板上鋪上已滅菌的玻璃紙，接種適量的孢子懸液，涂布均勻，30度培養適當時(shí)間，刮取菌絲體,在預冷的碾缽中加入液氮碾磨2~3次。收集粉末狀菌絲體小半勺于1.5 ml的指型管中。加入250 ul的懸浮緩沖液混勻置于冰上。

   2*.收集液體培養物(洗過(guò)的), 加入溶菌酶溶液（溶菌酶的終濃度為2 mg/ml，用P Buffer稀釋?zhuān)┦菇K體積250 ul。 于30度水浴15 min(原生質(zhì)體剛開(kāi)始形成)。

   3. 加入70 ul EDTA(0.25M) , 混勻。

   4. 加入375 ul的裂解緩沖液充分混勻，溶液呈清亮狀。

   5. 加入等體積的熱酚, 用手震蕩混勻, 于65度水浴5 min。 (a.水飽和酚應提前于65度加熱, 高溫下, 酚的溶解度加大。b. RNA在堿性環(huán)境中易分解。)

   6. 13,000 rpm離心5 min, 取上清。 (室溫下, 酚仍有少量與水混溶, 因而上清為乳白色。)

   7. 再次加入等體積的熱酚, 震蕩混勻,  于65度水浴5 min. 13,000 rpm離心5 min, 取上清。

   8. 加入等體積酚/氯仿(1:1), 震蕩混勻, 13,000 rpm離心5 min, 取上清。

   9. 加入等體積的氯仿, 震蕩混勻, 13,000 rpm離心5 min, 取上清。 (一定要充分震蕩, 以除盡殘余的酚, 否則, 酚會(huì )對后續實(shí)驗造成不良影響。)
   10.加入1/5體積的LiCl(10M), 兩倍體積的無(wú)水乙醇, 混勻, 于-20度放置2 hr。

11.于4度, 13,000 rpm, 30 min, 有白色沉淀。

12.用80%的冰乙醇洗兩次（在冰上進(jìn)行），以將鹽離子去除干凈。

13.冷凍真空干燥。

14.溶于適當的DEPC處理過(guò)的水中，于-70度保藏。

 

注：1. 所有的槍頭、指型管均需用DEPC(0.1%)（Takara）水處理。DEPC為油狀，不溶于水，應充分攪拌，使其均勻分散。

    2. 所有操作必須戴上手套，而且手套要經(jīng)常換。

      3. 水飽和酚： 將重蒸酚適量裝于一密閉瓶中，加入酚的1/2體積的去離子水，混勻，于65℃溫浴，使酚充分溶解于水。

 

   反轉錄：1. 反應體系（50 ul）

              模板（去除了DNA的RNA）            * ul

              引物（可以只是下游引物）（50 pmol/ul）   1 ul             

              dNTP (10 mM)                          1 ul 

              MgSO4                                2 ul

              5* buffer                               10 ul

              AMV                                  1 ul

              H2O                                   至50 ul

           2. 反應程序：

              模板、引物和水混合后60(或65)度保溫4 min（保證mRNA的強二級結構完全打開(kāi)），取出置于冰上再加入其他成分（避免AMV高溫失活）。

              48℃           45 min

              95℃           2 min

              4 ℃           5 min

              產(chǎn)物于-20℃保藏。

反轉錄產(chǎn)物可不經(jīng)純化直接用于常規PCR擴增。

 

注：1. 引物設計見(jiàn)常規PCR擴增。但要保證引物之間不會(huì )有干擾。

2. 模板中的DNA要去除干凈，做好陰性對照。（即以RNA為模板進(jìn)行相同的反應。）