鏈霉菌實(shí)驗操作4

1.       挑取保存的感受態(tài)細胞在LA平板上劃單菌落。

2.       挑取長(cháng)好的單菌落接入到裝有5ml LB的universal瓶中，搖床過(guò)夜培養。

3.       從universal中取1ml過(guò)夜培養物，轉接于裝有20ml LB（用SOC或SOB可提高感受態(tài)效率）的250ml三角瓶中，培養2.5~3小時(shí)至OD600＝0.6

4.       將培養物倒入50ml已預冷的大離心管中，置于冰上待冷卻

5.       離心，4℃.5000rpm.3分鐘

6.       倒去上清液，先加少量0.1M CaCl₂ ，打散沉淀，再加10ml，混勻，于冰上放置至少30分或過(guò)夜。

7.       離心，4℃.5000rpm.3分鐘

8.       棄上清，加1ml 0.1M CaCl₂，在冰上輕輕打散沉淀，即可使用。

以上步驟均需注意無(wú)菌和低溫操作。

 

1.       取100μl感受態(tài)細胞和5μl的酶連產(chǎn)物或1-2ul質(zhì)�；旌�

2.       冰上靜置30分鐘

3.       42℃熱激90秒，然后在冰上放置5min

4.       加0.75ml LB培養基，在37度搖床上培養45分鐘。然后3600轉離心2分鐘，去掉大部分上清。（此步不作為快轉，作為慢轉，慢轉可提高效率，有些抗生素如Kan篩選時(shí)用慢轉較好）

5.       涂布于有抗生素的篩選平板，一般12小時(shí)可有轉化子出現。

 

1.     從轉化子平板上挑取單菌落，在另一平板上劃小方塊，37℃擴大培養12小時(shí)

2.       刮取適量（偏少）的菌體懸浮于30μl快檢液I溶液中振蕩均勻

3.       加入15μl堿性SDS溶液（0.3mol/L NaOH, 2%SDS）（天冷時(shí)先使該溶液預熱），立即振蕩混合完全。

4.       在70℃放置15min（對大于20kb的質(zhì)粒則最好放在55℃, 30min）水浴時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)。

5.       冷卻至室溫，直接上樣跑瓊脂糖凝膠電泳檢測（如果菌體過(guò)多，則點(diǎn)樣時(shí)會(huì )發(fā)現樣品很粘，所以掌握不好時(shí)可以在第4步之后加上一部5ul苯酚抽提，離心的步驟。）

 

＊     如果沒(méi)有用苯酚處理，看膠時(shí)會(huì )發(fā)現很明顯的總DNA的條帶，但不影響實(shí)驗結果的觀(guān)察。

＊     點(diǎn)樣時(shí)注意點(diǎn)上質(zhì)粒載體質(zhì)粒對照，一般在快檢時(shí)會(huì )出現質(zhì)粒CCC構型的條帶，有時(shí)也會(huì )出現OC構型的。

＊     快檢液I：0.3M蔗糖，25mM pH8.0 Tris-HCl，0.5mM EDTA，0.02％溴甲酚綠

 

1.帶有oriT的目的質(zhì)粒轉化進(jìn)入大腸桿菌ET12567( pUZ8002),得到轉化子;

2. 將轉化子的過(guò)夜培養物轉接在LB中，在合適抗生素下,37 ^oC培養轉化子,到合適濃度(OD₆₀₀:0.4-0.6)收集菌體;

3. 用等體積新鮮的LB洗滌菌體兩次(洗掉抗生素), 0.1倍體積的LB懸浮.備用;

4. 鏈霉菌孢子的熱激和預萌發(fā)（一般的接合轉移只須做熱激）

    (1)新鮮孢子懸浮于5ml  0.05M  PH8.0 的TES;

    (2)50ºC水浴熱激10分鐘;

    (3)冷卻到室溫后加入等體積2X孢子預萌發(fā)培養基;

    (4)37ºC搖床分別培養2-３小時(shí);

   （5）離心收集孢子并重新懸浮于適量的水或TES中;

   （6）在振蕩器上打散孢子

或只作熱激按下面步驟：將適量的孢子加入1ml SOC或2倍YT培養基，50度處理10分鐘，離心，去大部分上清。

5. 按(1*e-8)：(1*e-9)與3中的大腸桿菌混勻(不一定)

6.  30ºC培養13-20小時(shí)左右用適當濃度的抗生素和萘啶酮酸（抑制大腸桿菌）覆蓋

6.  30ºC培養數天（一般2天）可得到接合轉移子.

7. 挑選接合轉移子到含適當抗生素和萘啶酮酸的平板上, 驗證;

（作篩選雙交換菌株時(shí)繼續作下面步驟）

8. 直接將得到的接合轉移子作影印，尋找單抗的菌株即為雙交換菌株。如果得不到，就要通過(guò)單交換菌株的松弛培養來(lái)得到雙交換菌株。得到的單交換接合轉移子劃線(xiàn)

于合適的培養基(含萘啶酮酸，不含別的抗生素)松弛培養;

9. 得到的孢子或菌體稀釋涂皿或劃單菌落（for Bld菌株）, 影印篩選雙交換.

 

注意事項:

1 不同的孢子熱激的溫度和時(shí)間不同,預培養的時(shí)間不同.

2 不同的鏈霉菌接合轉移所用的培養基不同

 

預萌發(fā)培養基

Difco 酵母膏  1%

  Difco 酪蛋白氨基酸    1%

  CaCl2   0.1M(需配制5M的原液,分開(kāi)滅菌后加到酵母膏/酪蛋白氨基酸溶液中去)

 

  1. 在裝有不銹鋼彈簧的三角瓶中加入250ml的YEME+TSBY(1:1)(一定要加Glycine)，接種100ul的孢子懸液，于30度搖床中培養36~40 hr（視具體情況，有時(shí)培養24h已足夠。）。

2. 將培養物倒入universal中，用無(wú)菌水涮洗三角瓶，收集洗液于同一universal中，然后3000 rpm離心10 min。

3. 棄上清，將菌絲體懸浮于15 ml的10.3%的蔗糖溶液中，3000 rpm離心10 min，棄上清。同此法洗兩次。

4. 取1 ml菌絲體，加入4 ml的溶菌酶溶液（溶菌酶母液為50mg/ml P Buffer，終濃度為2 mg/ml，用P Buffer稀釋?zhuān)�，�?0度水浴30~60 min（間隔七八分種輕輕搖動(dòng)）至上清呈乳狀。

5. 加入5 ml的P Buffer并用5 ml的吸管吹吸幾次，繼續溫浴10 min。（使大量的原生質(zhì)體釋放出來(lái)。）

6. 用裝有脫脂棉的試管過(guò)濾，濾液轉入無(wú)菌干凈的universal中，3000 rpm離心7 min（不用brake檔防止其破裂）。原生質(zhì)體沉淀呈黃色。

7. 棄上清 ，輕柔打散原生質(zhì)體，用P Buffer洗兩次（洗去溶菌酶）。每次仍使用3000 rpm離心7 min。（此步可省略）

8. 棄上清，用槍將原生質(zhì)體打散，分裝，于-70度保存。

 

注：1.. P緩沖液（原生質(zhì)體轉化用）（Okanishi, 1974）

  蔗糖103g，K₂SO₄ 0.25g, MgCl₂·6H₂O 2.02g, 微量元素溶液 2ml，蒸餾水 800ml

   滅菌后每80ml上述溶液中加入：0.5% KH₂PO₄ 1ml, 3.68% CaCl₂·2H₂O 10ml,  5.73% TES 緩沖液(pH7.2) 10ml

    2．溶菌時(shí)間不能過(guò)長(cháng)，否則會(huì )使原生質(zhì)體破裂。離心后若看到很粘的絮狀物，則說(shuō)明原生質(zhì)體破裂。

 

  1. 將最多5 ul的DNA（質(zhì)�；蛎高B產(chǎn)物）加于已經(jīng)裝有50 ul原生質(zhì)體的指型管（1.5 ml）的管壁上（不與原生質(zhì)體接觸）。

2. 吸取200ul的25% PEG4000（PEG應先滅菌，再用P Buffer配置），將DNA沖入原生質(zhì)體中，小心抽吸幾次使之混勻。

3. 將混合物涂布于R5平板上（不含任何抗生素）。

4. 30度培養14~20 hr后（待原生質(zhì)體再生后，即平板呈霧狀），用含有適當抗生素的1 ml無(wú)菌水溶液覆蓋。

5. 再培養1~2 d后，可以看到小的轉化子菌落長(cháng)出。

 

1. 將天藍色鏈霉菌庫斯質(zhì)粒轉化進(jìn)入大腸桿菌BW25113/pIJ790*菌株中，此步可用常規的CaCl₂ 法。（pIJ790帶有cat基因和對溫度敏感的復制區，培養時(shí)溫度要嚴格控制在30゜C以下）

2. 培養含庫斯質(zhì)粒的BW25113/pIJ790菌株：從平板上挑取大腸桿菌單菌落接入5ml 含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp的SOB-MgSO₄ （不加MgCl2 的SOB中加入MgSO4至20mM ）中，30゜C搖床培養過(guò)夜。

3. 取一部分過(guò)夜培養物至25ml新鮮的SOB-MgSO₄ 培養基（含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp）中，菌體終濃度為1% ，添加250ul 1M L-阿拉伯糖誘導λ/red  重組系統。

4. 30゜C ，200rpm搖床培養3-5h 至OD₆₀₀~0.6 。

5. 將培養物倒入預冷的30ml離心管中，冰上置10min(從此細胞溫度要保持在0~4゜C)。4000rpm  4゜C離心 5min。

6. 棄掉上清，加1ml預冷的10%甘油，在冰上打散沉淀，再加9ml 10%甘油,搖勻。

7. 4000rpm 4゜C離心 5min，棄掉上清，用10%甘油洗滌。重復上面操作：4000rpm 4゜C離心5min，盡量棄去上清，用殘留液將細胞打散。（感受態(tài)細胞濃度越高電轉效果越好）

8. 在預冷的0.2cm的電轉化杯中混合50ul感受態(tài)細胞與1-2ul PCR產(chǎn)物（經(jīng)純化，可盡量濃，但不能加得過(guò)多），混勻后立即電擊，電擊條件：200Ω,25uF,2.5kv, 電擊結果為4.5~4.9ms 較理想。（電轉化杯在70％乙醇中保存，用前先在無(wú)菌環(huán)境下用無(wú)水乙醇洗一下，再吹干，放冰上預冷，無(wú)水乙醇能加快吹干的速度。也可以選擇0.1cm的電轉化杯，但電擊的參數就得變?yōu)椋?.8 kV，？Ω,?uF）

9. 立即加1ml預冷的SOC，37゜C誘導培養40min（如需在同一庫斯質(zhì)粒上中斷基因，則30゜C誘導培養）。

10. 涂LA（含100ug/ml Amp及與電轉片段攜帶的抗性標記相應的抗生素）平板，37゜C過(guò)夜培養。（轉化子中含有兩種質(zhì)粒，分別是重組前和重組后的質(zhì)粒，所以要抽質(zhì)粒再轉化一次DH5a）