鏈霉菌實(shí)驗操作3

不同公司不同的酶要求的反應體系與反應條件會(huì )有不同，PCR反應可參考該酶的產(chǎn)品說(shuō)明上的反應體系與反應條件。

一般的反應體系如：

引物(50pmol/μl)	各1μl     反應終濃度:	各1pmol/μl
模板(約30ng/μl)	1μl	約30ng
Buffer(10´, 含Mg2+)	5μl	1´
dNTPs(10mM)	1μl	0.2μM
高溫聚合酶(5U/μl)	0.2～1μl	1－5U
ddH2O
總體積	50μl

PCR反應參考程序：

――――――――――――――――時(shí)間

Step 1   預變性     95-96℃       3-8min

Step2    變性       94℃         50sec

Step3     復性       ＊          50sec

Step4     延伸       72℃        ＊

Step5    2、3、4步驟循環(huán)（25次左右）；

Step6     延伸        72℃        10 min

4℃結束反應（4度長(cháng)時(shí)間保溫對PCR儀有較大損傷，一般不超過(guò)1小時(shí)便及時(shí)取出，絕對不允許過(guò)夜保溫）。

 

注：

                 引物應該用專(zhuān)門(mén)的軟件（如Primer Premier）認真設計，注意兩條引物的Tm值大致相等，GC含量較均一，引物自身以及之間不形成強的二級結構，特別是引物的3’ 端，引物不和模板其他位置形成強的配對（主要看引物3’端）。

                 MgCl2濃度依不同的模板和引物而定。MgCl2的濃度對PCR結果影響很大。

                 鏈霉菌的PCR因模板的GC含量高，可加DMSO（能降低復性溫度）其濃度可在0~10%之間變化。

                 模板為環(huán)形質(zhì)粒時(shí)若一次沒(méi)有擴增出來(lái)，可以考慮先用酶將其切成線(xiàn)性再作。

                 對高GC含量的模板，預變性的時(shí)間也可適當延長(cháng)，甚至先在沸水中煮5分種，然后迅速放入冰中。如果使用預變性溫度高或時(shí)間長(cháng)，一般要使用“熱啟動(dòng)”，即在預變性后再加入酶，這樣一是可以保護酶，二是可以避免低溫時(shí)酶的非特異性擴增。

                 現在的PCR儀一般都有“熱蓋”裝置，可以代替原來(lái)使用的礦物油，避免PCR過(guò)程中水份蒸發(fā)到管蓋上。

                 復性溫度依引物Tm值及引物與模板的匹配程度而定，提高復性溫度可提高擴增的特異性，而當無(wú)擴增條帶時(shí)，可適當降低復性溫度。

                 延伸時(shí)間可根據擴增區域的長(cháng)度確定，擴增區域越長(cháng)，延伸時(shí)間越長(cháng)。不同的聚合酶的延伸速度不一樣，具體看說(shuō)明書(shū)，一般高保真聚合酶平均每分鐘延伸600bp，普通Taq酶每分鐘延伸1kb。

                 根據不同需要使用不同的聚合酶，尤其當用于擴增表達的基因序列時(shí)，一定要使用高保真的酶，作普通的PCR驗證時(shí)就可用普通Taq酶。以鏈霉菌或其他高GC含量的DNA作模板時(shí)，由于GC含量越高，模板和引物的二級結構越復雜，延伸和配對越難，PCR反應不好做，可以暫時(shí)（2003年7月－）用TaKaRa的La Taq酶作普通的PCR，保真度不敢保證，但擴增效果很好。酶的用量可參考說(shuō)明書(shū)，并不是越多越好。

                 LA Taq酶的GC buffer往往能用于別的酶(如普通Taq酶或高保真酶probest)，使它們也能很容易地擴出高G+C的模板來(lái)。

 

 

注：1. 兩條模板的量無(wú)需太大，因盡量保證1:1。

    2. 保證引物之間不會(huì )有干擾

    3. 四條引物的PCR重組比三條引物的 PCR橋重組容易操作。即分別設計引物對兩個(gè)模板進(jìn)行擴增，使擴增后兩個(gè)模板有35-40bp的重疊序列，分別回收兩個(gè)模板在只有兩條外引物的條件下進(jìn)行常規PCR.

 

1. 引物設計：每條引物都要攜帶有所需的突變位點(diǎn)，引物一般長(cháng)25~45bp，設計的突變位點(diǎn)需位于引物中部。

2. PCR反應：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ；循環(huán)次數少，一般為12個(gè)循環(huán)。

  反應體系：

10x pyrobest Buffer                         5 ul

dNTP Mixture(10mM)                       1ul                   

模板DNA(5~50ng)                         1ul

primer 1 (125ng)                            1ul

primer 2 (125ng)                            1ul

pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5U/ul)    0.25ul

加無(wú)菌蒸餾水至                            50ul     

3. PCR產(chǎn)物沉淀純化：加1/10 體積的醋酸鈉，1倍體積的異丙醇，混勻置冰上（或-20゜C冰箱）5min，離心棄上清，70~75%乙醇洗鹽兩次，烘干后溶于無(wú)菌水中。（此步可省略，直接用 DpnI酶切）

4. DpnI酶切：   Buffer                   2ul

                BSA（100╳）           0.2ul

                DNA                    x ul

                DpnI                    0.5ul               

                加無(wú)菌去離子水至              20ul

  30゜C酶切 1~4 h ；65゜C 水浴15min 終止反應。

5. 將酶切產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a菌株，利用抗生素篩選突變子。

6. 測序驗證