醬油—大腸菌群的測定—乳糖發(fā)酵法

1  范圍

本方法采用乳糖發(fā)酵法測定醬油中大腸菌群的 MPN值。

本方法適用于醬油中大腸菌群的測定，以 MPN/100mL報告其結果。

2  原理

大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。

該菌主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來(lái)評價(jià)食品的衛生質(zhì)量，推斷食品中有

否污染腸道致病菌的可能。

3  試劑

3.1  溴甲酚紫溶液，0.4g/L 

3.2  乳糖膽鹽發(fā)酵管：將蛋白胨20g、豬膽鹽（或牛、羊膽鹽）5g及乳糖10g溶于1000 mL

水中，校正PH至 7.4，加入溴甲酚紫溶液25mL，混勻后分裝每管 10mL，并放入一個(gè)小倒管，115℃高壓滅菌 15min。

3.3   雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管：將蛋白胨 40g、豬膽鹽（或牛、羊膽鹽）10g 及乳糖 20g 溶于 1000 mL水中，校正PH至 7.4，加入溴甲酚紫溶液50mL，混勻后分裝每管10mL，并放入一個(gè)小倒管，115℃高壓滅菌15min。

3.4   乳糖發(fā)酵管：將蛋白胨 20g 及乳糖 10g 溶于 1000 mL 水中，校正 PH 至 7.4，加入溴甲酚紫溶液 25mL，混勻后按檢驗要求分裝 30 mL 、10mL、3 mL，并放入一個(gè)小倒管，115℃高壓滅菌15min。

3.5  EC肉湯：將胰蛋白胨 20g、3 號膽鹽（或混合膽鹽）1.5g、乳糖5g、磷酸氫二鉀 4g、磷酸二氫鉀 1.5g 及氯化鈉 5g 混合，溶于 1000 mL 水中，溶解后分裝有發(fā)酵倒管的試管中，并放入一個(gè)小倒管，121℃高壓滅菌 15min，最終PH  為 6.9±0.2。

3.6   伊紅美藍瓊脂平板： 將蛋白胨 10g、 磷酸氫二鉀 2g 及瓊脂 17g 溶解于蒸餾水中, 校正PH至 7.1 分裝于燒瓶?jì)龋?121℃高壓滅菌 15min， 臨用時(shí)加入乳糖 10g 并加熱溶化瓊脂， 冷至 50～55℃，加入伊紅美藍溶液（6.5g/L）10 mL，搖勻，傾注平板。

3.7   革蘭氏染色液：

3.7.1  結晶紫染色液：將1g 結晶紫溶解于 20 mL乙醇（950g/L）中，然后與80 mL 草酸銨溶液（10 g/L）混合均勻。

3.7.2  革蘭氏碘液：將1g 碘與 2g 碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。

3.7.3  沙黃復染液：將 0.25g 沙黃溶解于10 mL乙醇（950g/L）中， 然后用蒸餾水稀釋至 100mL。 

4  儀器

4.1  溫箱：36±1℃

4.2  恒溫水�。�44.5±0.5℃

4.3  顯微鏡

5  操作步驟

5.1  樣品處理：用點(diǎn)燃的酒精棉球燒灼瓶口滅菌，用石碳酸紗布蓋好，再用滅菌開(kāi)瓶器啟開(kāi)后進(jìn)行檢驗。

5.2 檢樣稀釋?zhuān)阂詿o(wú)菌操作，吸取醬油樣品25 mL，加入裝有 225mL滅菌蒸餾水的滅菌玻璃瓶?jì)冉?jīng)充分振搖做成1:10 的均勻稀釋液。

5.3乳糖發(fā)酵試驗

將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內，接種量分別為 10mL 、1mL、0.1 mL稀釋液，接

1種量在lmL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，lmI，及l(fā)mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3 管，置36 士l℃溫箱內，培養24士2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。

5.4 分離培養

    將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置 36 士 1℃溫箱內，培養18一24h，

然后取出，觀(guān)察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗。

5.5  革蘭氏染色試驗

    將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染 1min，水洗，然后滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗，再滴加乙醇（950g/L）脫色約30s，（或將乙醇滴滿(mǎn)整個(gè)涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿(mǎn)整個(gè)涂片，脫色 10s）水洗，最后滴加沙黃復染液復染 1min。水洗，待干，鏡檢。

革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，陰性菌呈紅色。

5.6   證實(shí)試驗

     在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落 1~2 個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，

置 36 士 1℃溫箱內培養 24 士 2h，觀(guān)察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽胞桿菌，即可報告為大腸菌群陽(yáng)性。

5.7  報告

     根據證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數，查MPN檢索表，報告每 100mL大腸菌群的 MPN值。