霍華德霉菌直接鏡檢計數法

1適用范圍

本方法適用于清汁、濁汁、水、濃縮果汁中霍華德霉菌直接鏡檢計數。

2設備和材料

2.1燒杯

2.2玻璃棒

2.3折光儀

2.4顯微鏡

2.5郝氏計測玻片

3 流程
取樣→稱(chēng)樣→稀釋→調節視野→涂片→觀(guān)察→記錄→計算 
4步驟
4.1 檢樣制備
    取定量檢樣，加蒸餾水稀釋至折光指數為1.344～1.3460（即濃度為7.9～8.8％）。用糖度計或折光儀測定折光指數或濃度，如果折光指數過(guò)大或過(guò)小，須加水或樣品，直至配成標準樣液，才能進(jìn)行檢驗。
4.2標準視野的調節
    霍德華霉菌計測用的顯微鏡，要求物鏡放大倍數為90～125倍，其視野直徑的實(shí)際長(cháng)度為1.382mm，則該視野為標準視野。
    檢查標準視野：將載玻片放在載物臺上，配片置于目鏡的光欄孔上，然后觀(guān)察。標準視野要具備兩個(gè)條件：載玻片上相距1.382mm的兩條平行線(xiàn)與視野相切；配片（測微器）的大方格四邊也與視野相切。如果發(fā)現上述兩個(gè)條件，其中有一條不符合，須經(jīng)校正后再使用。
4.3 涂片
4.3.1 檢查玻片
    首先用擦鏡紙或綢布沾酒精將載玻片和蓋玻片擦凈。檢查是否擦干凈，可將蓋蓋玻片置于載玻片的兩條突肩上觀(guān)察蓋玻片與載玻片突肩的接觸處是否產(chǎn)生牛頓環(huán)，如果沒(méi)有產(chǎn)生牛頓環(huán)，表明沒(méi)有擦凈，必須重新擦，直至產(chǎn)生牛頓環(huán)，方可使用。
4.3.2 加樣
    用滴管或玻棒取一大滴混合均勻的樣液，均勻地攤布于載玻片中央的平坦面上，蓋上蓋玻片（蓋玻片可直接蓋上去，也可以從突肩邊沿處吻合切入）。  如果發(fā)現樣液涂布不均勻、有氣泡、或樣液流入溝內、從蓋玻片與突肩處流出、蓋玻片與載玻片的突肩處不產(chǎn)生牛頓環(huán)等，應棄去不用，重新制作。  涂好的制片，在計測室內，每個(gè)標準視野的樣液體積為：
    πr²×0.1＝3.1416×（1.382/2）²×0.1＝0.15mm³
4.4 觀(guān)察記錄
4.4.1 觀(guān)察視野數及分布
    對一般樣品，每個(gè)涂片均檢查50個(gè)視野（每一個(gè)樣品至少應測25個(gè)視野，才能代表樣品的各個(gè)部分。如果檢查結果陽(yáng)性視野低于30％，則檢查25個(gè)視野即可；如果在30～40％之間，須檢查50個(gè)視野；如果在40～50％之間，須檢查100個(gè)視野；如果在50％以上或超過(guò)更多，則要繼續檢查，直至檢查25個(gè)視野的結果與一系列計算結果無(wú)差異為止）。所檢查的50個(gè)視野要均勻地分布在計測室上，可用顯微鏡載物臺上帶有標尺的推進(jìn)器來(lái)控制，從上到下，或從左到右一行行有規律地進(jìn)行觀(guān)察。
4.4.2 霉菌菌絲的鑒別 
    在同一視野內霉菌菌絲的特征是：
4.4.2.1 霉菌菌絲一般粗細均勻 
4.4.2.2 霉菌菌絲體內含有顆粒，具有一定的透明度 
4.4.2.3 有的霉菌菌絲有橫隔 

4.4.2.4 有的霉菌菌絲有分支  
    當在標準視野下不能確認為霉菌菌絲時(shí)，可放大200倍或400倍上下調節視野，觀(guān)察不同平面的菌絲。
4.4.3 記錄結果
4.4.3.1 陽(yáng)性視野與陰性視野的判斷：在標準視野下，上下調節焦距發(fā)現有霉菌菌絲，其長(cháng)度超過(guò)標準視野直徑（1.382mm）的1/6（即一個(gè)小方格的邊長(cháng)）或三根菌絲總長(cháng)度超過(guò)標準視野直徑的1/6，這個(gè)視野稱(chēng)為陽(yáng)性視野，否則稱(chēng)為陰性視野。有時(shí)在標準視野中出現極細的菌絲叢或小菌落，則以其直徑來(lái)計算，超過(guò)視野直徑1/6為陽(yáng)性視野，否則為陰性視野。陽(yáng)性視野用“＋”表示；陰性視野用“－”表示之。
4.4.3.2 對初次學(xué)習霍德華霉菌計測法者，作記錄前，先在記錄紙上劃出計測室上50視野均勻分布的小格，觀(guān)察一個(gè)標準視野，立即在相應的方格內作“＋”或“－”的記錄，或“－”以空格表示之。
這種記錄方法，在計測過(guò)程中，可減少重復或遺漏計數的現象，也可以從記錄表格上“＋”、“－”視野的分布，了解涂片是否均勻。
如果一個(gè)樣品做兩個(gè)片子，觀(guān)察結果誤差較大（超過(guò)6％），則另取樣涂片，觀(guān)察測定至誤差＜6％時(shí)為止。  
5結果
5.1 計算
    霍德華霉菌計測數值，又稱(chēng)霉菌數，用百分比表示。其含義如下：
將0.15mm3標準樣液，均勻地攤布成厚0.1mm，直徑為1.382mm，其面積為1.5mm2的標準視野，在顯微鏡下檢查。按100個(gè)視野數計算，其中發(fā)現有霉菌菌絲存在的視野數（即陽(yáng)性視野數）。
 根據霉菌數含義，其計算公式如下：

 霉菌數（％）＝ ×100％    
 舉例：記錄的陽(yáng)性視野數，片1為15，片2為16，則樣品的霉菌數為：
 樣品霉菌數（％）＝ ×1/2×100％＝31％

5.2 注意事項
    部頒標準為陽(yáng)性視野不超過(guò)40％，在國際貿易中，合同上無(wú)要求時(shí)按部頒標準執行，合同上有要求時(shí)按合同執行;每抽取一罐樣品制兩個(gè)片子，每片觀(guān)察50個(gè)視野，如果超過(guò)標準指標，應該繼續制片，但片子數量不得少于3片即150個(gè)視野，如果計測結果相近時(shí)，可取其平均值;如對抽樣結果有異議，應加倍抽樣。全部合格，作為合格處理，其中有一罐不合格，該批作為不合格處理。
5.3 報告  
  作好計測記錄，按記錄計算計測結果并作報告。