豬細小病毒

豬細小病毒(Porcineparvoviurs)同義名：豬細小DNA病毒��

　豬細小病毒(PPV)是Mary和Mahnel于1966年進(jìn)行豬瘟病毒組織培養時(shí)發(fā)現的，并認為是培養細胞內潛伏感染的病毒。隨后相繼從一些正常豬腎細胞培養物和感染豬瘟病毒的豬腎細胞中發(fā)現直徑為22～23nm的病毒粒子，并認為與Kilham(1959)發(fā)現的大鼠細小病毒相似。通過(guò)核酸鑒定證明為DNA型。Cartwright等(1967)在對豬的不孕癥和流產(chǎn)、死產(chǎn)的病原學(xué)研究中，從病料中分離出了豬細小病毒，從而首次證明了它的致病作用。通過(guò)血清學(xué)鑒定證實(shí)，所有上述分離毒株，包括從一些傳代細胞系中分離的類(lèi)似病毒均與PPV同屬一型，盡管名稱(chēng)各異。��從六十年代中期分離病毒和逐步明確其致病作用以來(lái)，已相繼從歐洲、美洲、亞洲等很多國家分到病毒或查出抗體。它在豬群中檢出率甚高：如美國一些豬群的血清抗體陽(yáng)性率達50%～80%，丹麥12%～42%，澳大利亞52%，英國19%～56%，德國54%。在日本，據估計約10%的豬流產(chǎn)是由本病毒引起的。我國已先后在北京、上海、吉林、黑龍江、四川和淅江等地分離到了PPV，血清學(xué)調查的陽(yáng)性率為80%。

�ァ糂T4〗1.形態(tài)和理化學(xué)特性�ァ　〔《就庥^(guān)呈六角形或圓形，無(wú)囊膜，直徑20～23nm，二十面體等軸立體對稱(chēng)，衣殼由32個(gè)殼粒組成。核心含單股線(xiàn)狀DNA，分子量為1��4×10��6,G＋C＝48%。DNA分子量約占整個(gè)病毒粒子分子量(5��3×10��6)的26��5%。病毒粒子在氯化銫中的浮密度為1��37～1��39g/cm��3，沉淀系數為105S。�ァ糑H4〗〖JZ〗〖HT5”SS〗圖37-2 豬細小病毒的免疫〖WB〗電鏡(橫杠=100nm)�ァ糄W〗——自楊盛華�オァ糎T5SS〗　　與多數細小病毒一樣，PPV對加熱具有強大的抵抗力。據Cartwright等的試驗資料(1967)，當56℃30分鐘加熱處理時(shí)，無(wú)論病毒的傳染性還是凝集紅細胞的能力，都無(wú)明顯改變。在70℃經(jīng)2小時(shí)加熱處理后，其感染力雖有所下降，但并不喪失。但80℃經(jīng)5分鐘加熱即可使其失去活性。病毒對酸有較強的抵抗性，在pH3～9間穩定。�ァ　〔《緦σ颐�、氯仿等脂溶劑有抵抗力。短時(shí)間的(如1小時(shí))胰酶處理對病毒懸液感染性不僅沒(méi)有影響，而且能提高其感染效價(jià)，這可能是由于胰酶使病毒粒子在懸液中進(jìn)一步分散的緣故。�ァ　〗M織培養的病毒懸液或保存在pH9甘油緩沖鹽水中的病毒，在－20℃和－70℃下，經(jīng)一年以上的保存，無(wú)論其感染效價(jià)和血凝性都不減弱。

�ァ糂T4〗2.血凝性��PPV能凝集鼠、豚鼠、恒河猴、雞、鵝和人O型紅細胞。75℃以上加熱處理后，病毒的血凝效價(jià)幾乎完全消失。弱酸性到中性的介質(zhì)適于血凝特性的保持。病毒感染的細胞培養物對紅細胞的吸附作用很弱或沒(méi)有。

�ァ糂T4〗3.培養�ァ　�PPV只能在來(lái)源于豬的細胞(包括原代豬腎、豬睪丸細胞和傳代系PK��15)和人的某些傳代細胞(如Hela、KB、HEp��2、Lu132等)中培養增殖，其中以原代豬腎細胞較為常用。�ァ　�為了獲得大量的病毒和使細胞出現明顯的病變，要求在多數細胞處于旺盛的有絲分裂期進(jìn)行病毒接種，不能象一般常規那樣，待細胞形成單層后才接種病毒。為此，可于培養細胞同時(shí)，最遲也不超過(guò)24小時(shí)，就進(jìn)行病毒接種。當接種時(shí)機適當，病毒接種量又大時(shí)，病毒大量迅速增殖，于2～5天出現細胞病變，7～8天達到收獲程度。初期，細胞呈彌漫性顆粒樣變化，繼之發(fā)生圓縮和脫落，有時(shí)整個(gè)細胞層全部掉光。但接種時(shí)機過(guò)遲和接毒量太小時(shí)，往往看不到細胞病變，連續盲傳后，致細胞病變作用可以增強。�ァ　≡诟腥镜呢i腎細胞核內，最早可于接種后18小時(shí)發(fā)現A型包涵體(HE染色)，其中存在大量的病毒粒子(圖37-3)。應用免疫熒光檢測包涵體，發(fā)現有病毒抗原存在。

 

4.病原性�ァ　￠L(cháng)期以來(lái)，人們懷疑PPV是豬繁殖障礙和胎兒畸形的病原之一。病毒可通過(guò)胎盤(pán)引起胎兒感染。Mengeling應用豬胚腎原代細胞培養物，從屠宰場(chǎng)宰殺的98頭妊娠母豬中的3頭母豬的胎兒分離到了病毒；又從82窩經(jīng)子宮切開(kāi)術(shù)取胎并被剝奪初乳的新生仔豬中的3窩，檢出了高效價(jià)的血凝抑制抗體。此外，他還應用免疫熒光法從6個(gè)月木乃伊化的胎兒檢出了病毒抗原，隨后又用組織培養法分離出了病毒。據日本于1970～1974年的調查，本病毒引起的流產(chǎn)和死產(chǎn)多發(fā)于8～10月，且主要限于春、夏期間配種的初產(chǎn)母豬，因為經(jīng)產(chǎn)豬多已發(fā)生感染免疫。流產(chǎn)可發(fā)生于全部妊娠期，但以妊娠中期前感染最為易發(fā)。�ァ　∪斯そ臃N胎兒試驗表明，隨妊娠期的不同，感染結果有明顯差別。如據Bachmann等的資料(1975)，于妊娠后35、48和55天感染時(shí)，胎兒經(jīng)5～22天死亡，并呈現木乃伊化，能從其臟器分離出病毒。于妊娠后72、94和105天感染時(shí)，胎兒不僅存活并產(chǎn)生高滴度的抗體。成年豬人工感染不呈現臨床癥狀，幼齡仔豬人工感染后可能發(fā)生倦怠、食欲不振、嘔吐、下痢、跛行等癥狀。自然情況下，也常能從健康豬中分離到病毒。這些都表明存在無(wú)癥狀潛伏感染的豬。��

　

5.流行病學(xué)�ァ　〔《灸芡ㄟ^(guò)胎盤(pán)傳染給胎兒，形成垂直傳播，這已為很多實(shí)驗所證實(shí)。Lucas等(1974)在被感染的公豬睪丸內發(fā)現了病毒，并證明能通過(guò)交配傳染給母豬。病豬分泌液、排泄物及被其污染的器具均可引起傳播。妊娠后期感染的胎兒雖出生后不見(jiàn)異常，但很可能成為傳染源。由于本病毒常呈潛伏狀態(tài)存在，故在進(jìn)行正常組織培養時(shí)，往往出現這種病毒的污染。�ァ　⊙�清學(xué)調查表明PPV感染在豬群中普遍存在，90%以上的老母豬和78%的小母豬呈PPV抗體陽(yáng)性。部分6～8月齡母豬在第一次懷孕時(shí)對PPV無(wú)免疫力。在一項調查中，30%的小母豬和公豬的PPV血凝抑制抗體(HI)滴度低于1∶32，說(shuō)明被動(dòng)免疫已經(jīng)降低。相反，98%的成年母豬的HI滴度高于1∶256，它們已產(chǎn)生了主動(dòng)免疫。新生仔豬從血清陽(yáng)性母豬的初乳中可獲得較高水平的抗PPV抗體，但抗體滴度以后逐漸降低，到6～9月齡時(shí)，不能再檢出抗體。此時(shí)，第一次懷孕的小母豬如果遭受PPV感染，最容易發(fā)生繁殖障礙。��

6.免疫��據Mayr和Cartwright等的試驗資料，人工接種后，豬血清中于6～9天出現HI抗體，14～21天抗體滴度可達1024～5000倍。與接種豬密切接觸的健康豬也呈現同樣高的抗體滴度。由于70日齡以上胎兒感染時(shí)，在子宮內即可產(chǎn)生抗體，所以感染仔豬出生后，即可檢出很高水平的抗體，這也是本病的一個(gè)特點(diǎn)�？贵w水平隨豬的年齡增長(cháng)而逐漸下降。但由于本病毒與本屬其它病毒一樣具有潛伏感染的特性，位于局部的病毒，能不斷地刺激機體產(chǎn)生免疫反應，所以低水平的抗體可持續很長(cháng)時(shí)期。除血凝抑制抗體外，中和抗體、補結抗體也經(jīng)常出現在循環(huán)血液中。

 

��7.診斷�ブ饕�靠分離病毒和血凝抑制試驗。前者主要用于流產(chǎn)和死產(chǎn)胎兒，后者用于可疑病豬的診斷。

　(1)病毒的分離和鑒定�ァ　⊥ǔ２扇】梢闪鳟a(chǎn)和死產(chǎn)胎兒的腎、肺、肝、腦、睪丸和胎盤(pán)等作為分離病毒的病料。從感染仔豬分離病毒時(shí)，以腸系膜淋巴結和肝臟的分離率最高。病料經(jīng)研磨制成5～10倍乳劑，將離心后的上清接種于尚未形成單層的原代豬腎細胞或SK細胞系培養物內，也可與培養細胞同時(shí)接種。初次分離病毒時(shí)，一般不用PK��15細胞系，因其不如前兩種細胞敏感。標本中病毒濃度較高時(shí)，于接種后24～72小時(shí)出現細胞病變，當大部細胞出現病變和脫落時(shí)收獲(如果細胞病變不明顯，可進(jìn)行盲傳)。此時(shí)病毒濃度可達10��5～10����6��5�猅CID��5��0/0��2ml，血凝效價(jià)可達1∶1024。核內包涵體一般在接種后16～36小時(shí)出現。�ァ　∮迷�代豬腎細胞培養分離病毒時(shí)，必須設不接種病料的空白對照培養，而且要盲傳3代，只有當對照培養物正常，接種病料的培養瓶出現細胞病變時(shí)，才能判為病毒分離陽(yáng)性，即病毒確系來(lái)自被檢標本，而非來(lái)自分離培養病毒用的豬腎細胞。�ァ　�據一些研究者的資料，直接應用病料組織，如腎、肺和睪丸等進(jìn)行單層細胞培養，較接種其它易感細胞更容易成功，但病料組織一定要新鮮無(wú)菌，才能達到目的。�ァ　”静《局挥幸粋�(gè)血清型，且與其它病毒不呈現交叉反應，所以應用已知標準免疫血清進(jìn)行血清學(xué)反應，即可達到鑒定目的。其中以血凝抑制試驗最常應用，其次為中和試驗。簡(jiǎn)易快速的方法是在組織培養分離病毒過(guò)程中，應用免疫熒光抗體染色法直接檢查單層細胞培養物，也可獲得滿(mǎn)意結果。�ァ　〔《九囵B物的血凝試驗，在病毒鑒定上也有重要參考價(jià)值。它能凝集豚鼠、恒河猴、人O型、新生雛雞、鵝、犬和小鼠的紅細胞，不凝集豬、馬、牛和兔的紅細胞，實(shí)驗室最常應用豚鼠紅細胞。利用一段PPVDNA序列，用同位素或非同位素標記物標記，制成核酸探針，從病料中檢測PPV是近年來(lái)發(fā)展的診斷方法，它明顯提高了診斷的敏感性和特異性。�ァ�

　(2)特異性抗體的檢驗�ァ　、傺�凝抑制試驗：是最常用的血清學(xué)診斷法，可用試管或微量滴定板進(jìn)行。血清先經(jīng)56℃30分鐘滅活，然后用50%豚鼠紅細胞吸附除去血清中的非特異性凝集素，即可用于試驗。首先以緩沖鹽水對血清作倍比稀釋(可從4倍開(kāi)始到4096倍)，然后向每個(gè)稀釋度的血清中加入等量的血凝抗原(含4個(gè)血凝單位)，混勻后室溫感作1小時(shí)后，加入等量的0��5%～1��0%豚鼠紅細胞懸液，混勻，放4℃下經(jīng)4～6小時(shí)判定。同時(shí)設已知的陰、陽(yáng)性血清對照。滴度1∶8以上判為陽(yáng)性。感染豬能產(chǎn)生很高的血凝抑制抗體，最高可達4000倍以上。�ァ　、谥泻驮囼灒嚎捎肧K細胞系或豬腎繼代細胞，采取血清稀釋法，同時(shí)設已知陰、陽(yáng)性血清對照。病毒滴度約100TCID��5��0/0��1ml。向經(jīng)過(guò)滅活的不同稀釋度的血清管內，加入等量病毒懸液，混勻后放置2小時(shí)，取0��2ml分別接種3～4支培養管，在輕度振蕩下吸附1小時(shí)(37℃)，然后補足維持液，放旋轉鼓上或靜止培養，經(jīng)5～10天判定。��

8.預防�ァ　『髠淠肛i進(jìn)入繁殖群，常常成為易感個(gè)體，并因感染而發(fā)生繁殖失敗。所以將后備母豬群與經(jīng)產(chǎn)母豬隔離能減少自然感染。應經(jīng)常檢查種公豬的感染狀況，淘汰陽(yáng)性公豬，因感染種公豬的精液帶毒可通過(guò)交配而傳播病毒。�ァ　、僮匀桓腥久庖叻ǎ涸诖嬖诒静〉呢i場(chǎng)，可以考慮采用自然感染免疫法，即在后備種豬群中放進(jìn)一些血清陽(yáng)性的經(jīng)產(chǎn)母豬，或將后備母豬放在感染圈內飼養約1個(gè)月左右，使其受到自然感染而產(chǎn)生主動(dòng)免疫力。此法的缺點(diǎn)是豬場(chǎng)長(cháng)期遭受污染。�ァ　、诿庖呓臃N：由于PPV血清型單一及其高免疫原性，使得疫苗接種成為控制PPV感染的一種行之有效的方法。于繁殖前給母豬接種疫苗是世界上大部分地區共用的方法。滅活疫苗、弱毒疫苗均可使用。��

a.弱毒疫苗：PPV毒株NADL��2在細胞培養上經(jīng)過(guò)50多代已馴化成為一種活疫苗。將疫苗經(jīng)口服、鼻內接種血清陰性的懷孕小母豬不引起胎兒感染，但子宮內接種對胎兒有致病性。與強毒株NADL��8比較，1000倍的NADL��2才能引起胎兒死亡。這種活疫苗在母豬繁殖前接種可產(chǎn)生免疫反應，保護強毒的攻擊。Fujisaki等(1978)將有毒力的PPV在低溫(30℃)豬腎細胞上傳54代，產(chǎn)生的變異株稱(chēng)為HT，它接種豬后不產(chǎn)生病毒血癥和排毒，但能誘導產(chǎn)生高滴度的抗體和較強的免疫力。將HT株再在豬腎細胞上培養并用紫外線(xiàn)照射后傳代，獲得了安全性和免疫原性更好的HT�睸K�睠株。�ァ　∈Y玉雯等由廣西初產(chǎn)母豬所產(chǎn)死胎的內臟分離獲得1株自然弱毒株-N株。給1713頭后備母豬在配種前進(jìn)行田間試驗，接種后HI抗體上升，免疫保護效果良好，母豬的產(chǎn)仔率、所產(chǎn)仔豬的成活率都明顯提高。��