6.5 轉染QBI-293A細胞
表現 可能原因 解決方法
無(wú)空斑 a） 制備的質(zhì)粒質(zhì)量差 用氯化銫密度梯度法純化用于轉染的質(zhì)粒
b） 時(shí)間問(wèn)題 棄去培養板之前先等2~3周或更長(cháng)�？瞻邔⒃�2~3周內逐漸形成，如果重組子高表達蛋白，這個(gè)過(guò)程將更慢
c） 轉染操作 用陽(yáng)性對照來(lái)檢驗轉染效率
d） 細胞拮抗腺病毒 從細胞庫中復蘇另一管細胞
e） 病毒質(zhì)粒未經(jīng) PacI線(xiàn)性化 閉環(huán)質(zhì)粒不會(huì )形成病毒空斑，轉化前必須用PacI進(jìn)行線(xiàn)性化
空斑太多 高轉染效率導致空斑密度過(guò)高 由于太多數被轉染細胞都將產(chǎn)生病毒空斑（79.5%），轉染時(shí)請使用較少量的腺病毒DNA
轉染后細胞高死亡率 a） 轉染后鈣離子未徹底去除 轉染后先后用PBS/EDTA和PBS各洗一遍，去除鈣離子
b）轉染后細胞經(jīng)胰酶消化 細胞在轉染后非常脆弱，極易從壁上脫落。不要使用胰酶進(jìn)行消化，這樣做不僅不必要，而且還可能導致活著(zhù)的細胞死亡
覆蓋的瓊脂糖不清澈 瓊脂糖被污染 使用無(wú)菌的瓊脂糖
6.6篩選和測定
表現 可能原因 解決方法無(wú)重組子 a） 挑中了背景空斑（即首先出現或最大的空斑） 挑空斑之前先等14~17天.
b） 達到或超過(guò)了載體的最大克隆能力 確認是否超過(guò)最大克隆能力；若有疑問(wèn)請聯(lián)系技術(shù)支持（info@qbi.com）
c） 插入基因產(chǎn)物有毒 在293細胞中暫時(shí)性表達蛋白以評價(jià)氣度性。若有毒，請替換未可誘導或較弱的啟動(dòng)子
d）插入基因缺失 重組時(shí)因某些未知原因可能導致基因缺失，應篩選較多的克隆
擴增后插入基因丟失 有RCA，當大量擴增時(shí)可能發(fā)生回復突變 1）檢測是否含有RCA或感染非允許細胞
2）聯(lián)系技術(shù)支持，請教如何檢測和限制這一現象
3）用原始病毒保存液重新空斑純化病毒
重組時(shí)將插入基因丟失 用原始病毒保存液重新擴增
6.7 在QBI-293A細胞中表達
表現 可能原因 解決方法
重組蛋白不表達 a）基因未插入重組病毒 用病毒保存液進(jìn)行PCR反應，檢測是否含有目的基因
b）表達水平太低，所用方法無(wú)法檢測到 優(yōu)化檢測蛋白表達的條件
蛋白表達水平太低 a）蛋白表達的克隆設計不夠優(yōu)化，如非翻譯區太長(cháng)、離啟動(dòng)子太遠等等 選擇最佳蛋白表達克隆。這些因素在進(jìn)行克隆設計時(shí)就應考慮到
b）啟動(dòng)子不太適合在所用的細胞類(lèi)型中表達蛋白 用另一類(lèi)型細胞驗證蛋白表達情況
6. 8 重組腺病毒的擴增
表現 可能原因 解決方法
病毒溶液終濃度低 病毒增值速度慢，這和很多因素有關(guān)，如插入基因的大小、毒性和重組情況等等 1） 感染時(shí)間從48小時(shí)增加到72小時(shí)，以產(chǎn)生完全的CPE
2） 保證三次凍融都很完全
3） 如果需要，用更大的培養器皿和更多的細胞進(jìn)行更大量的擴增（代數不能太多）
6. 9 純化
表現 可能原因 解決方法
第一次氯化銫離心后無(wú)條帶形成 a） 收集的細胞量太少
b）病毒量太多 1） 感染的細胞量不夠。至少需要3×108細胞，當病毒生長(cháng)緩慢時(shí)則需更多細胞
2） 降低稀釋度
上樣量密度過(guò)大將使分離失效，適當稀釋上樣液
第二次氯化銫離心后無(wú)條帶形成 第一步操作不當導致病毒丟失 吸取病毒帶時(shí)必須非常小心，寧可吸到污染的雜質(zhì)也不要漏吸，第二步將會(huì )去除污染的缺陷性顆粒第二次離心后條帶分離不清晰 a) 氯化銫密度梯度制備質(zhì)量差
b) 離心問(wèn)題 1） 連續密度梯度必須使用密度梯度發(fā)生器小心制備，離心前切勿將梯度打亂
2） 稀釋第一步中得到的病毒帶
3） 不要使用直徑比推薦值小的離心管，否則條帶將變大
檢查離心記錄，速度和時(shí)間都會(huì )影響分離效果
6.10 病毒滴度測定
表現可能原因 解決方法
OD260測得的滴度與空斑測定或TCID50測定獲得的滴度無(wú)相關(guān)性 a） 含有大量缺陷性顆粒
b） 稀釋錯誤
c） 細胞密度不夠 用兩次氯化銫離心純化病毒，去除缺陷性顆粒 精確測定滴度時(shí)，每個(gè)稀釋度都應有復孔，稀釋時(shí)必須換用槍頭
進(jìn)行滴度測定時(shí)細胞必須50~60%匯合
無(wú)CPE或空斑 a） 保存液滴度太低，無(wú)法檢測到
b） 時(shí)間問(wèn)題 1） 使用陽(yáng)性對照，以確保方法和溶液的有效性
2） 降低保存液的稀釋度
在推薦時(shí)間內等待空斑形成和CPE出現 保存后滴度降低 緩沖液不對或儲存不當 1） 使用含2mMgcl2和5%蔗糖的10mM Tris緩沖液，PH8.0，PH值對于長(cháng)期保存至關(guān)重要
2） 將病毒保存于-80℃，不主張長(cháng)期保存于-20℃
3） 將病毒分裝成小份，以免反復凍融后降低滴度
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