6.1 QBI-293A細胞培養
表現 可能原因 解決方法
細胞高死亡率/細胞脫壁/培養液發(fā)黃 支原體、細菌或酵母菌污染 1） 復蘇一管新的細胞
2） 使用抗生素如鏈霉素和青霉素
細胞生長(cháng)困難 a) 細胞太少 QBI-293A細胞傳代時(shí)至少為5%匯合率，以保證其在一定時(shí)間內恢復生長(cháng)
b) 細胞密度過(guò)高 QBI-293A如果經(jīng)常培養密度過(guò)高，則有產(chǎn)生突變的危險，細胞匯合率切勿超過(guò)70%
6.2 感染力測定
表現 可能原因 解決方法
感染后細胞高死亡率 a） MOI過(guò)高 降低MOI
b） 細胞內含有內源性病毒（野生型腺病毒可產(chǎn)生輔助病毒樣作用，使非重組腺病毒也能感染細胞） 更換凍存的細胞，初代培養的較適用 ;
c） 一些細胞株有類(lèi)似E1區活性 若一定要使用該細胞株,改用較低MOI
不感染 a) MOI太低 1) 嘗試不同范圍MOI。對于293之外的細胞株，MOI一般為1~200，對于某些難于感染的細胞株可能需要更高
2) 如果使用的是Infect+陽(yáng)性對照，儲存液在應用之前首先應擴增
b) 感染條件不夠優(yōu)化 1）任何感染試驗都需以293細胞為陽(yáng)性對照
2）以未感染的293作為陰性對照來(lái)監測細胞培養條件
c) 一些細胞可拮抗腺病毒的感染,需要很高M(jìn)OI 聯(lián)系技術(shù)支持（info•qbi.com）
6.3 轉移載體克隆
表現 可能原因 解決方法
轉化大腸桿菌后無(wú)菌落形成 a） 抗生素應用不當
b） 轉化效率差 .
c） 制備的質(zhì)粒質(zhì)量差 使用50ug/ml卡那霉素
確證細胞是否具有轉化活性
用氯化銫或其它方法純化質(zhì)粒
轉化后有太多菌落形成 培養基中無(wú)抗生素 培養基中加入卡那霉素
篩選的克隆中無(wú)目的基因 a） 不匹配粘末端連接
b） 鈍末端連接導致無(wú)轉化
c） 連接頭太短，不能被有效切割
d） Taq酶在PCR片段末端產(chǎn)生太多突出性腺嘌呤 確證酶切后DNA粘末端是否匹配加大連接酶量，確證克隆位點(diǎn)已正確應用，Klenow進(jìn)行鈍化 確證連接頭之間有足夠的堿基對以供正確酶切。詳細信息可向內切酶供應商查詢(xún)
Taq酶在PCR產(chǎn)物3’末端可產(chǎn)生一個(gè)額外的腺嘌呤。必須移去這個(gè)額外的腺嘌呤（可用Klenow）或者使用產(chǎn)生鈍末端的溫度穩定性聚合酶
轉移載體重組子的分子量不正確 使用了錯誤的載體或克隆基因 cDNA用膠純化，確保連接前無(wú)其它載體污染
限制性?xún)惹忻笩o(wú)法切割質(zhì)粒 a） 甲基化
b） 酶已失活
檢驗切割的序列是否對甲基化敏感，若是，則在對甲基化不敏感的細菌如GM33中擴增質(zhì)粒使用新鮮的酶和制造商推薦的緩沖液
6.4 在BJ5183細胞中共轉化和重組
表現 可能原因 解決方法
菌落少或無(wú)菌落 a) 轉化效率不夠
b) 抗生素使用錯誤或濃度過(guò)高
c) 制備的質(zhì)粒質(zhì)量差
d) 細胞轉化活性
e) 使用了錯誤的細菌株 1） 按照試驗盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，這是一個(gè)關(guān)鍵步驟，必須使用最優(yōu)條件
2） 向電穿孔儀制造商查詢(xún)適用于這一細胞的特定操作方法
抗生素為50ug/ml卡那霉素
1） 用氯化銫或其它方法純化質(zhì)粒
2） 膠純化可降低背景菌落的形成，但也可能降低了轉化效率。當轉化效率太低時(shí)避免使用膠純化
1） 試劑盒中提供的細菌都具有電穿孔轉化活性，如果使用其它方法進(jìn)行轉化，則必須將細胞制備為化學(xué)轉化活性
2） 細菌必須正確保存以免喪失轉化活性，參照推薦的方法保存
使用試劑盒中提供的BJ5183細菌株，DH5α僅供用于重組子的擴增，因其無(wú)重組活性。
菌落過(guò)多 a) 轉移載體和病毒DNA的比率過(guò)高 I^1,
b) 轉移載體用PmeI線(xiàn)性化不完全
c) 卡那霉素質(zhì)量差或量不夠 1） PmeI消化后用膠純化或去磷酸化質(zhì)粒
2） 共轉染時(shí)減少轉移載體的量，推薦比率為：1ug轉移載體:0.1ug超螺旋DAdEasy-1 DNA
PmeI酶切時(shí)減少DNA量，檢查內切酶是否具有活性
使用新鮮的卡那霉素，濃度為50ul/ml
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