病毒滴度測定

  有很多名詞都用來(lái)描述病毒溶液的滴度。

1． VP（病毒顆粒）或OPV（光學(xué)顆粒單位）

2． GTU（基因轉移單位）或轉導顆粒（BFU即藍點(diǎn)形成單位，與GTU類(lèi)似）

3． PFU（空斑形成單位） 

4． TCID50（50%組織培養感染劑量） 

不同的概念緣于不同的滴度測定方法，這些方法包括2類(lèi)：物理方法（VP）和生物學(xué)方法（GTU、PFU、TCID50）。

1． 測定VP的方法是測定病毒顆粒在260nm處的吸光度（病毒DNA和蛋白的總吸光度中主要為DNA），1個(gè)OD值相當于1.1×1012個(gè)病毒顆粒。用這種方法進(jìn)行測定在各個(gè)實(shí)驗室中都較為穩定，但它不能區分感染性和缺陷性病毒顆粒。因此這種方法只能提供病毒的量，至于質(zhì)，比如是否含有缺陷性顆粒則沒(méi)有考慮在內。

2． GTU則測定感染后能表達報告基因的細胞數量。這個(gè)過(guò)程中，病毒將DNA轉入細胞，在一個(gè)感染周期結束前立即測定表達報告基因的細胞。如果重組腺病毒含有報告基因如GFP或LacZ等則可以用這種方法進(jìn)行測定，病毒保存液通常不用這種方法來(lái)進(jìn)行描述。

3． PFU是測定腺病毒滴度最早的標準方法，主要測定單層細胞培養中病毒裂解空斑的形成�？瞻咝纬尚枰�許多個(gè)感染周期，得到最終結果通常需要三個(gè)星期。一般來(lái)說(shuō)，這種方法得到的結果很少能在其它實(shí)驗室重復，即使在同一實(shí)驗室內，不同技術(shù)員操作也很少能得到相同的結果。

4． TCID50已被用于測定許多種病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。病毒稀釋液與細胞在96孔板進(jìn)行培養，然后監測每孔是否CPE。TCID50方法相對PFU方法而言有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，如速度是PFU的2倍，結果更具預料性，在不同操作個(gè)體間也更穩定。

所有生物學(xué)方法所得到的結果在不同實(shí)驗室之間往往有所差異，它主要與病毒感染方法有關(guān)。許多因素如加入的病毒儲存液的量、管子的類(lèi)型、培養的時(shí)間、細胞和培養液的量等都會(huì )影響結果。最近，出現了兩種測定病毒滴度的改良方法。一種是用更小體積的病毒液進(jìn)行感染并在感染過(guò)程中不斷晃動(dòng)培養板（Mittereoler等，1996）；另一種方法則在感染時(shí)將培養板進(jìn)行離心（1000 RCF90分鐘）（Nyberg-Hoffman等，1997）。這兩個(gè)實(shí)驗室所得到的結果更為穩定，并證實(shí)以前的方法低估了病毒保存液中感染性病毒顆粒的數量。迄今為止，尚無(wú)一種方法被控制機構認定為測定滴度的標準方法。

對于同一管病毒保存液，不同的方法所得到的結果往往相差100倍以上，典型的數據見(jiàn)表6。所有結果都只是大概的，目前最有效的生物學(xué)方法（離心法感染）能檢測到1個(gè)感染性顆粒/2個(gè)顆粒。下一部分，我們將詳細描述3種不同的測定病毒滴度的方法。選擇滴定方法要考慮的關(guān)鍵因素包括可重復性、穩定性、敏感性、易用性和耗時(shí)。無(wú)論選擇那種方法，稀釋和滴定過(guò)程必須重復操作以得到精確結果。一般來(lái)說(shuō)，用TCID50方法得到的病毒保存液的滴度應為：

      106~107         第一代細胞經(jīng)凍融后

      108~109         100倍數量的細胞經(jīng)過(guò)凍融后

      1010~1011       用氯化銫方法純化后

表6：各滴度測定方法特性

方法 類(lèi)型 時(shí)間 可重復性 滴度* 評注 

VP 物理學(xué)方法 2小時(shí) 好 5×1012

GTU 生物學(xué)方法 2天 可變 2×1011

PFU 生物學(xué)方法 21天 變化很大 5×1010 傳統方法

TCID50 生物學(xué)方法 10天 可變 2.5×1011 昆騰公司標準方法

以VP法測得的5×1012的病毒保存液為標準

5.8.1 O.D.260 nm（VP/ml）

這種方法只是通過(guò)DNA量來(lái)表示病毒滴度。相關(guān)系數為1.1×1012/ OD260 單位。由于大多數分光光度計在OD值小于0.1時(shí)不夠精確，而樣品準備過(guò)程中又至少要稀釋10倍，因此如果 OD值大于0.1，我們可以估計病毒量大于1012。這一方法只可用于測定氯化銫純化后溶于緩沖液中的病毒，因含血清培養基會(huì )干擾吸光度。同時(shí)，它也要求病毒濃度足夠高，并且不含缺陷性顆粒。

1． 4℃融化病毒保存液。

2． 在無(wú)菌超凈臺內用病毒裂解液（VLB）（0.1%SDS，10mMTris PH7.4，1mMEDTH）準備二個(gè)病毒稀釋度。

最小需要量為： s 

病毒裂解液   病毒       稀釋度

52ul       52ul       1：2（稀釋液1）

168ul      42ul       1：5（稀釋液2）

注意：病毒滴度高時(shí)（1013/ml）用1：10和1：20稀釋度，滴度低時(shí)用低稀釋度，保證OD值在0.1~1.0之間。

3． 56℃震蕩培養10分鐘。  0 uf'gbjf 

4． 準備1ml含有VLB和透析緩沖液的空白對照溶液，比例同上，以緩沖液代替病毒裂解液。

5． 測定260nm處吸光值：

稀釋液1再稀釋1：5，為稀釋液3。

稀釋液2再稀釋1：5和1：10，分別為稀釋液4和稀釋液5。

測定稀釋液5（2次）、4、3的OD260，取此4值的平均值作為最終結果。 

例如

1． 將450ulVLB和50ul稀釋液即透析緩沖液加入比色杯中。

2． 記下空白管讀數后棄去，不要沖洗。

3． 加入450ulVLB和50ul 1：5稀釋樣本（稀釋液2），組成稀釋液5。

4． 記下讀數后棄去。

5． 清洗比色杯，加入樣本重復測一次。

6． 清洗比色杯，加入400ul VLB和100ul 1：5稀釋空白液。 

7． 記下空白管讀數后棄去，不要清洗。

8． 加入400ul VLB和100ul 1：5稀釋樣本，組成稀釋液4。

9． 記下讀數后棄去。

10． 清洗比色杯，加入400ul VLB和100ul 1：2稀釋空白液。

11． 記下空白讀數后棄去，不要清洗。

12． 加入400ul VLB和100ul 1：2稀釋樣本，組成稀釋液3。

13． 記下讀數后棄去。

將吸光值與稀釋度相關(guān)系數相乘即可得出病毒滴度：

OD260×病毒稀釋度×測定稀釋度×1.1×1012= OPU/ml

5.8.2 空斑測定法

空斑法測定滴度的主要原理是病毒感染QBI-293A細胞后，通過(guò)一個(gè)感染周期便可再感染鄰近細胞，直至形成一個(gè)成熟的空斑。這是所有生物學(xué)方法測定病毒滴度中最具挑戰性的方法。由于許多因素如單層細胞質(zhì)量、操作和觀(guān)察方法等都可影響到最后的結果，因此這一方法得到的結果往往最不穩定。

1． 5×105細胞/60mm培養皿用5ml DMEM5%培養，3-4小時(shí)后等細胞貼壁即可進(jìn)行病毒感染�；蛘咴诓《靖腥厩耙惶旒尤�3×105細胞/60mm培養皿

。

2． 在12孔板中稀釋病毒，儲存于-20℃或-80℃備用。第1個(gè)稀釋孔將病毒保存液稀釋至1ml，其它孔稀釋至3ml，大體積可提高可重復性。稀釋濃度原則視病毒濃度而定（純化還是未純化的），調節稀釋度至10-100個(gè)病毒/孔，一般為10-12，這樣稀釋比大約為10-7~10-12。

稀釋?zhuān)簩?00ul病毒保存液加入900ul DMEM5%。用移液器上下吸打5次，此時(shí)稀釋度為10-1。換用新槍頭將300ul 10-1稀釋液加入2.7ml DMEM5%吸打5次，稀釋度為10-2。然后分別取300ul前一稀釋液加入2.7ml DMEM5%，形成一系列稀釋度，最后4個(gè)稀釋度用于感染細胞。

注意：每次稀釋時(shí)都必須換用新槍頭。

3． 吸去細胞培養液，每個(gè)培養皿中加入1ml病毒稀釋液和1ml DMEM5%，十字形輕輕晃動(dòng)混勻，37℃培養90分鐘。

4． 吸去培養液，按5.2.2中所述加入1.25%瓊脂糖培養基。

5． 37℃培養,經(jīng)常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鮮培養基。21天后應該可以看到空斑形成的白色小斑點(diǎn)。

結果:計數有多少個(gè)獨立的空斑形成，將此數目乘以稀釋度即可得到每毫升產(chǎn)生的空斑形成單位(PFU/ml)。

5.8.3 50%組織培養感染劑量法

此方法基于最高稀釋度下在QBI-293A細胞中CPE的形成，它是昆騰公司用于測定滴度的標準方法。

5.8.3.1 細胞準備：

1． 收集一瓶QBI-293A細胞，計數。

2． 用DMEM 2%準備20ml 105/ml細胞。

3． 用12道排槍在2塊96孔板中每孔加入100ul細胞懸液。

5.8.3.2 準備稀釋病毒液

1． 第1管中加入0.9ml DMEM 2%，其余加入1.8ml。第1管中再加入0.1ml病毒保存液。

2． 上下吸打5次混勻。

3． 換用新槍頭。

4． 從第1管中吸取0.2ml加入第2管中。

5． 反復稀釋至最高稀釋度。

6． 用同一管病毒保存液進(jìn)行第2輪稀釋。

7． 最后8個(gè)稀釋液加入96孔板，每孔0.1ml，每個(gè)稀釋度10孔，2孔為陰性對照。陰性對照孔中加入0.1ml DMEM 2%監測細胞存活情況。加樣時(shí)從最高稀釋度開(kāi)始。

8． 37℃培養10天。

9． 10天后倒置顯微鏡下觀(guān)察，計算每一排中出現CPE的孔數。只要有一小點(diǎn)或是一些細胞出現CPE即為陽(yáng)性，如果無(wú)法確定，可與陰性對照比較。

10． 計算每一排中出現陽(yáng)性的孔數。

如果陰性對照中無(wú)任何CPE且細胞生長(cháng)良好，最低稀釋度100%陽(yáng)性而最高稀釋度100%

陰性，則本測試即為有效。

圖7：TCID50的典型結果 

稀釋度孔對 照

稀釋度 比率 3v q- /  2 

10-10 0/10=0 uc% ?\0jo# 

10-9 0/10=0 F78?54dN]2 

10-8 2/10=0.2 ' 7]<Qo ¬g 

10-7 6/10=0.6 HG1gai 7Z# 

10-6 10/10=1 |_?1%0rv> 

10-5 10/10=1 oQ =  | d, 

10-4 10/10=1 iE  +F ' 5 

10-3 10/10=1 D 8| *gu&o 

在這一例子中，當稀釋度為10-6時(shí)出現100%陽(yáng)性，當稀釋為10-9時(shí)出現0%陽(yáng)性。因此，滴度可以用KARBER統計法精確算出：對于100ul的稀釋液，滴度為T(mén)=101+d（s-0.5）

d=log10稀釋度=1（對于10倍的稀釋度而言）

s=陽(yáng)性比率之和（從第1個(gè)10倍稀釋度開(kāi)始）=1+1+1+1+1+1+0.6+0.2+0+0=6.8。

雖然一些低稀釋度在測定中省略了（如10-1和10-2），但在計算時(shí)仍應以陽(yáng)性比率為1來(lái)算。

滴度：T=101+1（6.8-0.5）=107.3（100ul病毒保存液中）

T=100.3≈2×108 TCID50/ml。 

說(shuō)明：我們已經(jīng)證實(shí)，TCID50法測到的滴度d=log10值比標準空斑法高0.7。

將TCID50/ml轉換為PFU/ml：

T=1×108.3 TCID50/ml=1×108.3-0.7 PFU/ml=1×107.6 PFU/ml≈4×107 PFU/ml。