一旦重組病毒已被純化和鑒定，即可在QBI-293A細胞中進(jìn)行大量擴增。本手冊提供了遞增培養規模和腺病毒感染周期的基本方法，按這一方法最終得到的病毒量約為3×1011~3×1012。由于一個(gè)細胞中所含的病毒顆粒為1000~10000，因此1L培養細胞可得到約5×1012病毒顆粒。如果要把病毒用氯化銫梯度離心純化，則必須至少3×108的細胞，這樣才能正確分辨出病毒帶。對于蛋白表達，則根據需要可在任何一步擴增步驟中停止，離心沉淀細胞后按照適當的操作方法進(jìn)行蛋白抽提（根據蛋白類(lèi)型的不同抽提上清或細胞沉淀）。為優(yōu)化時(shí)間進(jìn)程，每個(gè)感染周期必須與下一次細胞擴增培養同步。如果由于各種原因不能同步，則必須將病毒凍存，直至下一次細胞培養開(kāi)始后再融化病毒。注意每次擴增都將會(huì )剩下一些病毒，這些病毒先不必丟棄，以便下一步擴增失敗時(shí)備用。每次擴增最好都用最低代的病毒顆粒，這樣產(chǎn)生突變型病毒的可能性會(huì )大大降低。
操作步驟：
1. 在100mm培養皿或75cm2培養瓶中加入10ml DMEM5%培養5×106 QBI-293A細胞。
2. 取0.5ul首次擴增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混勻，這樣稀釋?xiě)玫降腗OI值約為5。
3. 移去培養液，小心加入病毒混合液，切勿破壞細胞單層，十字形慢慢晃動(dòng)3次，37℃ CO2孵箱中培養90分鐘。
4. 加入9ml DMEM5%。
5. 再培養72小時(shí)，這時(shí)在10ml溶液中大約有5×109~5×1010個(gè)病毒顆粒，進(jìn)行MOI測定以估計病毒顆粒（5.3）。
如果此時(shí)得到的病毒量已足夠，可立即進(jìn)行病毒滴度測定（5.8）。收集細胞，600×g離心5分鐘沉淀細胞，去上清后加入最小體積（一般為原始體積的1/10即1ml）病毒保存溶液重懸細胞。-20℃/37℃凍融3次，臺式離心機上以最大速率離心去除細胞碎片，收集上清，然后按5.8進(jìn)行病毒滴定。
6. -20℃/37℃凍融3次。
7. 轉入15ml無(wú)菌離心管中，臺式離心機上以最大速率離心10分鐘，收集上清凍存于-20℃或-80℃。
8. 3個(gè)175cm2培養瓶中各加入107 QBI-293A細胞進(jìn)行培養。
9. 將3ml細胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中，混勻。移去細胞培養液，每瓶小心加入5ml混合液，十字形慢慢晃動(dòng)混勻3次，37℃CO2孵箱中培
養90分鐘。此時(shí)MOI值約為25。
10. 加入DMEM5%至30ml。
11. 再培養48~72小時(shí)。此時(shí)10ml培養液病毒量約為3×1010~3×1011。若需要，進(jìn)行MOI測定（5.3）以估計病毒滴度。此時(shí)如果病毒量已足夠，則可立即進(jìn)入病毒滴定步驟（5.8）。600×g離心5分鐘收集細胞，棄上清，加入1/10原始體積的溶液重懸細胞。-20℃/37℃凍融3次，臺式離心機上以最大速率沉淀細胞碎片，收集上清，按5.8章中所述進(jìn)行病毒滴定。
12． 移入50ml離心管中，臺式離心機上最大速率離心10分鐘，取出上清保存。 S1 3ZdaHiJ
13． 30瓶175 cm2培養瓶中每瓶各加入107 QBI-293A細胞。
14． 將45ml細胞裂解液上清加入105ml DMEM5%混勻，從培養瓶中移去培養液，加入5ml混合液感染細胞，十字形緩慢晃動(dòng)3次混勻，37℃培養90分鐘。此時(shí)MOI值約為25。
15． 加入DMEM5%至30ml/瓶。
16． 再培養48-72小時(shí)，此時(shí)約有3×1011~3×1012個(gè)病毒。若需要，進(jìn)行MOI測定估計病毒滴度。如果要收集病毒顆粒，先收集被感染細胞，然后重懸在5ml DMEM5%中。-20℃/37℃凍融3次，離心沉淀細胞碎片。此時(shí)5ml DMEM5%中3×1011~3×1012個(gè)病毒顆粒，濃度為6×1010~6×1011vp/ml。然后按5.8章中所述滴定病毒儲存液，或者用標準的氯化銫密度梯度離心法純化病毒。在109細胞中擴增病毒可獲得大量病毒保存液，而在1010細胞中擴增則有一定技術(shù)性。切勿將擴增后的病毒保存液再用來(lái)感染細胞，因這會(huì )大大增加RCA產(chǎn)生量。有時(shí)不得不使用純化空斑以最大可能降低RCA產(chǎn)量。如果已沒(méi)有純化的空斑，那么就不得不重新空斑純化重組病毒，鑒定克隆后再進(jìn)行擴增。如果需要大于擴增4輪后的病毒量，注意請用早期的病毒作為擴增源。比如，用第2代病毒產(chǎn)生第3代病毒。如果沒(méi)有第2代病毒，那么必須用第1代病毒來(lái)產(chǎn)生新的第2代病毒。按這個(gè)原則進(jìn)行擴增可使RCA水平盡可能低。如果用于表達蛋白，則可以收集細胞后根據蛋白特點(diǎn)選擇適當方法抽提蛋白。細胞沉淀中一般可提取1-5mg蛋白，建議在小規模擴增后先測定感染后抽提蛋白的最佳時(shí)間，然后再大量擴增蛋白。
表5：腺病毒擴增
第一代 第二代 第三代 第四代 21D c}GlEH
每瓶細胞數 1×105 5×106 1×107 1×107
培養瓶大小
（cm2） 75 175 175
培養瓶數 24孔板1孔 1 3 30
感染來(lái)源 稀釋的空斑 首次擴增后的病毒保存液 第二代病毒 第三代病毒
每瓶接種量 0.1 mL 0.5 mL或 n d
2.5×107 1 mL 1.5 mL
總培養體積 1 mL 10 mL 90 mL 900 mL
MOI 0.01 5 25 25 A
滴度（VP/mL） 1×108~9 5×108~9 3.3×108~9 3.3×108~9
總病毒量 1×108~9 5×109~10 3×1010~11 3×1011~12
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