重組腺病毒的篩選和純化

  腺病毒轉移載體和腺病毒DNA通過(guò)在體同源重組產(chǎn)生重組腺病毒，這涉及到復雜的反應和基因重排或突變，導致病毒呈現不同的表型。雖然重組腺病毒DNA在細菌內重組后已篩選到含有插入基因，但我們還是建議按照下面的操作步驟對細胞內產(chǎn)生的重組腺病毒進(jìn)行鑒定。

 

5.5.1 挑選最佳重組腺病毒：表達和基因輸送

重組腺病毒的挑選取決于病毒表達蛋白和增殖的能力。比如有兩個(gè)不同特性的克隆，第一個(gè)克隆蛋白表達很好而且病毒可增殖至5000VP/細胞，而第二個(gè)克隆雖然蛋白表達水平只達到第一個(gè)克隆的75%，但是卻可以增殖到10000VP/細胞。擴增的時(shí)候，第二個(gè)克隆10L產(chǎn)量中的病毒數量即可達到第一個(gè)克隆20L的產(chǎn)量，這樣當需要大量擴增病毒時(shí)第二個(gè)克隆是較好的選擇，而且產(chǎn)物足以產(chǎn)生生物學(xué)效應。篩選方法的選擇取決于病毒最終的應用。如果用于蛋白表達，那么必須使用能監測蛋白表達水平的方法；如果要挑選能有效擴增的克隆，那么就用能定量檢測DNA產(chǎn)量的方法。簡(jiǎn)單的重組腺病毒篩選可用PCR方法，這一技術(shù)只檢測病毒中的重組DNA，而不能篩選特定的表型。其它技術(shù)不但能篩選重組病毒，同時(shí)也能挑選特定的表型�？寺〉奶暨x可根據：

1. 每個(gè)細胞產(chǎn)生病毒的數量。這可以用Southern雜交的方法，因為病毒DNA量與每個(gè)細胞的病毒含量有關(guān)。能產(chǎn)生高水平病毒量的克隆有利于生產(chǎn)高滴度的病毒儲存液，但是增殖最佳的克隆未必能最有效地表達蛋白。

2. 每個(gè)細胞蛋白表達的水平。這可以用Western雜交或功能測定的方法。

請注意有些最佳克隆可能會(huì )較難培養。因此篩選方法的選擇取決于用來(lái)觀(guān)察生物學(xué)效應的蛋白表達水平和重組腺病毒的最終應用。

表4提供了選擇最佳篩選方法的向導。報告基因、表達蛋白的抗體和功能測定的敏感性將影響操作方法的選擇。得到最初結果的時(shí)間對方法的選擇也很重要，但這一原則必須慎重考慮，因為如果最終目的是生產(chǎn)大量病毒，那么一個(gè)10倍量高產(chǎn)的克隆只需擴增1L即能達到原來(lái)10L的病毒量，這時(shí)使用快速篩選方法所節省的時(shí)間會(huì )在大量擴增過(guò)程中完全耗費掉。

表4：各種篩選方法的特性 

篩選方法 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)

Western雜交顯示表達蛋白的完整性 顯示插入基因的蛋白表達水平 

 可以用與其它蛋白有交叉反應的抗體，因為蛋白會(huì )在膠上得到分離 需要表達蛋白的抗體得到最終結果需兩個(gè)星Southern雜交 或點(diǎn)雜交使用克隆基因作為探針,無(wú)須特殊試劑 通過(guò)信號強弱間接測定每個(gè)細胞內的病毒數量 需從病毒儲存液中額外擴增，整個(gè)流程需要一周時(shí)間僅能檢測克隆的基因 PCR迅速，使用擴增病毒的儲存液只需1天時(shí)間 僅能檢測克隆的基因且無(wú)法定量 ，可能需要優(yōu)化克隆基因的PCR條件免疫測定相對快速，總共需要3天時(shí)間，顯示插入基因的蛋白表達水平需要與細胞蛋白無(wú)交叉反應的特異性抗體

功能測定直接顯示蛋白的完整性和功能 需從病毒儲存液中額外擴增，整個(gè)流程需要一周時(shí)間對于大多數方法來(lái)說(shuō)，信號密度與蛋白的表達水平、病毒DNA的增殖程度以及病毒保存液的純度有關(guān)�？瞻呖偭恐械年�(yáng)性率提示克隆的純度高低。比較不同克隆間的信號密度水平時(shí)克隆的純度非常重要，也就是說(shuō)必須保證所有篩選出來(lái)的空斑必須100%陽(yáng)性。

5.5.2病毒空斑挑選和小量擴增 VKAo zOV P 

通過(guò)AdEasyTM系統純化得到的細菌克隆而產(chǎn)生的病毒空斑應該幾乎都是（95%）重組病毒。每個(gè)細菌克隆最好測定至少1~2個(gè)空斑的表型。

操作步驟

1. 從培養板上挑選6~12個(gè)空斑，標上圓圈。

2. 無(wú)菌條件下用200μL槍頭挑出克隆并轉入含0.5mL DMEM5%/孔的24孔板。 

3. 37℃病毒24小時(shí)。

4. 鋪一塊每孔含1×105 QBI-293A細胞的24孔板。

5. 移去培養液，輕輕加入100μL步驟3中清洗的病毒（約103病毒顆粒），切勿將細胞吹起，十字型輕輕晃動(dòng)3次，轉入CO2孵箱37℃培養90分鐘。

6. 加入DMEM5%，使總體積為1mL，輕輕混勻。

7. 37℃ CO2孵箱培養直至完全出現CPE，在此MOI值下一般需要5~10天。如果10天后還沒(méi)出現CPE，說(shuō)明此克隆的病毒量太低，需要進(jìn)行第二輪擴增。

8. 為從細胞中釋放病毒，在-20℃和37℃中充分凍融細胞3次。

9. 收集細胞，在15mL離心管中打碎。臺式離心機上以最大轉速離心10分鐘，收集上清并儲存于-80℃。這一凍存液中大約有5×107VP/mL。如步驟7中所述，如果在第一次擴增后CPE不完全，則進(jìn)行第二輪擴增。由于QBI-293A細胞含有腺病毒基因組的E1區，因此E1區缺失的腺病毒與人染色體發(fā)生同源重組而產(chǎn)生有增殖能力的腺病毒（RCA）的機率很低。

發(fā)生這種回復突變的機率大約為1/107，這種腺病毒的增殖速度比重組腺病毒快。首輪擴增產(chǎn)生的腺病毒保存液是十分重要的，因為它含有RCA 的可能性最低。這種保存液必須節約使用，并保存好所有低代病毒，以便進(jìn)行大量擴增，不可用已傳過(guò)數代的病毒進(jìn)行大量擴增。低代病毒DMEM5%溶液可在-80℃條件下保存數年。所以，保存好低代病毒可避免進(jìn)行重復篩選和純化病毒克隆的工作。

在這一期間可以選擇適當的方法來(lái)篩選重組病毒，當所有病毒空斑100%為正確的重組病毒時(shí)可以認為這個(gè)克隆為純的。如果此時(shí)病毒仍然不純，則可以進(jìn)行第二輪空斑純化，然后再用適當方法進(jìn)行篩選。

 

5.5.3 Western 雜交

以下內容提供了進(jìn)行Western雜交的一般指導。按照本手冊制備的初次病毒擴增保存液已足夠用來(lái)檢測大多數腺病毒蛋白，SDS-PAGE、抗體反應和檢測系統的具體操作請參考標準實(shí)驗手冊。

1. 在5×105細胞/孔的24孔板中每孔加入500μL DMEM5%培養液，然后再每孔加入200μL初次病毒擴增保存液感染48小時(shí)。

2. 確證所有細胞均出現CPE，如果CPE不完全則再延長(cháng)感染24小時(shí)。

3. 取出400μL轉入1.5mL試管中，其余-80℃凍存。 

4. 800rpm離心5分鐘，棄上清后用20μL PBS重懸細胞，用P20移液槍充分混勻重懸細胞。

5. 加入20μL 2 × Laemmli緩沖液（注意：對于某些蛋白和抗體，這一步使用不含巰基乙醇的緩沖液至關(guān)重要）。

6. 煮沸5分鐘。

7. SDS-PAGE上樣。

不同克隆抽提物中的蛋白含量變化很大，上樣量勿過(guò)量。在顯微鏡下先測定每個(gè)樣品的蛋白含量對于獲得好的結果十分重要，每孔的蛋白上樣量大約為5~10μg。

 

5.5.4 Souther雜交和點(diǎn)雜交

1． 六孔板中加入2×106 QBI-293A細胞，然后加入含500-10

5.5.5病毒裂解產(chǎn)物PCR

理論上講，這是篩選重組病毒最快的方法，但是很難預料一對引物能否正常工作，因此常常需要優(yōu)化PCR條件。如果把優(yōu)化PCR條件的時(shí)間也計算在內，那么獲得最終結果需要的時(shí)間可能和其它定量方法差不多。PCR反應可直接用初次擴增得到的病毒保存液進(jìn)行（5.5.2，第9步）。一個(gè)25ul反應體積的標準PCR反應需要4ul病毒保存液（無(wú)需抽提），25pM引物和1單位Taq酶，取5-10ul進(jìn)行電泳分析。標準的PCR過(guò)程請參考通用的分子生物學(xué)手冊。如果PCR擴增無(wú)效，則反應前需象Souther雜交一樣抽提DNA（Hirt法）。其實(shí)，每個(gè)克隆用酶切反應進(jìn)行分析更為合適，因為盡管酶切和PCR需要相同的時(shí)間，但酶切分析更能確認重組病毒的序列結構。

 

5.5.6 免疫

這是最快的篩選方法。免疫測定可直接在培養孔進(jìn)行，一天內即可完成。但這方法需要特異的抗體，而且無(wú)法定量。具體操作請參考相應的標準免疫測定方法。

1． 如5.2.1中所述，用初次擴增的病毒保存液感染細胞。 

2． 4%多聚甲醛固定感染的細胞20分鐘，PBS洗2次，如果需要可用0.075%曲拉通/ PBS滲透，PBS洗2次以上，2%BSA阻斷60分鐘。

3． 加入一抗37℃培養60分鐘。

4． PBS洗兩次。

5． 加入標準的二抗（FITC，緘性磷酸酶，辣根過(guò)氧化物酶等）進(jìn)行孵育。  

6． 用相應方法進(jìn)行蛋白顯色。

5.5.7 功能測定

有些蛋白的功能可直接進(jìn)行測定。如果目的是進(jìn)行蛋白表達，那么建議用評價(jià)蛋白功能的方法來(lái)篩選病毒，必須應用能準確評價(jià)蛋白質(zhì)量的方法，操作應視需要進(jìn)行相應調整。以下是分離含有完整蛋白的被感染細胞的一般方法：

1． 在每孔含5×105細胞的24孔板中，每孔加入700ul含200ul首次病毒擴增保存液（5.5.2，第9步）的DMEM5%，培養48小時(shí)。

2． 觀(guān)察細胞直至完全出現CPE，如果CPE不完全，再延長(cháng)感染24小時(shí)。

3． 取出400ul轉入1.5ml離心管中，將剩余的300ul凍于-80℃。