QBI-293A細胞的感染和病毒空斑的產(chǎn)生

  感染QBI-293A細胞和產(chǎn)生病毒空斑在這本手冊的多種操作中都得到應用，其具體操作視不同的實(shí)驗目的而稍有差異（如滴度測定、大規模擴增和純化）。這一節提供了一個(gè)基本的操作說(shuō)明，并詳細描述了QBI-293A細胞感染后不同時(shí)間的具體變化。

5.2.1 感染QBI-293A細胞

QBI-293A細胞中腺病毒的感染周期表現為光鏡下可見(jiàn)的細胞表型的改變，此周期始于病毒和細胞接觸后。被感染細胞的表型變化與病毒接觸的時(shí)間以及病毒細胞比率相關(guān)，這個(gè)比率稱(chēng)為感染復數（MOI）。病毒控制細胞并阻止細胞的生長(cháng)需要幾個(gè)小時(shí)的時(shí)間。 10~20的MOI值通常用于需要同時(shí)感染所有細胞時(shí)，此時(shí)細胞匯合率應該在90~95%左右，因為細胞在感染數小時(shí)內將停止生長(cháng)。加入病毒的量可通過(guò)MOI值測定（見(jiàn)5.3）或病毒滴度測定（見(jiàn)5.8）確定。在這個(gè)MOI值條件下，被感染細胞的形態(tài)在1~2天后就會(huì )完全改變：細胞變圓并逐漸從壁上脫落（見(jiàn)5.2.2）。隨著(zhù)病毒的增殖，細胞核將占據細胞的大部分，這一表現稱(chēng)為細胞病理效應（CPE）。感染后3天，所有細胞都將呈現CPE。當QBI-293A細胞在MOI值為1或更低的情況下被感染，則只有一部分細胞能被感染。此時(shí)感染所有的細胞必須產(chǎn)生完整的感染周期并釋放病毒，整個(gè)過(guò)程大概需要4天。在這個(gè)過(guò)程中，未被感染的細胞將繼續生長(cháng)，細胞可能在未被全部感染時(shí)達到100%匯合率而停止生長(cháng)。感染后的表現是多種多樣的，但典型的表現是在感染后5天可見(jiàn)大多數細胞呈現CPE而其余的細胞表現為原來(lái)未被感染的形態(tài)。感染的操作很簡(jiǎn)單，只要將病毒與細胞接觸。為增加感染的有效性，在最初2小時(shí)感染中最好將培養液的體積減到最小，這樣病毒與細胞接觸得會(huì )更緊密，然后再增加培養液。此外，緩慢而持續地晃動(dòng)培養板（Mittereder et al. 1996）可使病毒分布更均勻，從而使感染效果更好。 注意：處理細胞和病毒時(shí)都必須使用消毒的槍頭。

5.2.2 病毒空斑形成

病毒空斑形成源于一個(gè)細胞被一個(gè)病毒感染后，經(jīng)過(guò)多次完整的感染周期釋放病毒再感染周?chē)�的細胞。病毒空斑的形成是一個(gè)緩慢的過(guò)程，甚至在光鏡下能觀(guān)察到空斑之前，細胞已經(jīng)達到100%匯合。為限制病毒的擴散，通常在培養液中加入瓊脂糖，但在瓊脂糖覆蓋下觀(guān)察細胞形態(tài)的改變則要稍微困難一些。感染后7天左右可以在顯微鏡下看到小的空斑，表現為一定區域內細胞呈現CPE。第10天可以在光鏡下看到形態(tài)完整的空斑，有經(jīng)驗的研究者則能憑肉眼觀(guān)察到培養板底部有小的空白斑點(diǎn)形成。到14天，空斑可非常容易地被挑選出來(lái)。

 

5.2.3 瓊脂糖覆蓋被感染細胞

將瓊脂糖覆蓋細胞不是一項容易的技術(shù)，你必須在瓊脂糖凝固之前迅速地將它在單層細胞上完全鋪勻。但是如果鋪得太快太重，那么細胞往往會(huì )脫壁。但通過(guò)幾次實(shí)驗后，這一步應該比較容易了。瓊脂糖/DMEM混合物制備：

 

1. 用無(wú)菌PBS制備5% SeaPlaque瓊脂糖（FMC產(chǎn)品）儲存液，高壓消毒后每管10mL分裝在50mL塑料離心管中，4℃保存。

 

2. 使用之前先在微波爐中融化5% SeaPlaque瓊脂糖（避免沸騰），然后冷至45℃。防止瓊脂糖沸騰最好的辦法是在沸水浴中加熱，如果沒(méi)有完全融化的話(huà)再在微波爐中加熱數秒。

 

3. 加入30mL預平衡至37℃的DMEM5% 后充分混勻，這樣瓊脂糖的終濃度為1.25%。立即使用。覆蓋QBI-293A細胞：  在進(jìn)行下一步操作之前，請確認細胞是否已貼壁完好。

1. 移去培養液，用1.25%瓊脂糖/DMEM混合物覆蓋單層細胞。 

2. 沿著(zhù)培養板的邊緣將瓊脂糖輕輕加入，加入的具體體積參考表3，然后放回CO2孵箱培養。

表3：不同培養器皿應用的瓊脂糖體積

培養皿大小 首次量 追加量  

100 mm 10 mL 5 mL 

60 mm 5 mL 3 mL  

6孔板 3 mL 1.5 mL