QBI-293A細胞培養

293A細胞來(lái)源于一個(gè)用作空斑測定的亞克隆，具有易使用和易轉染的特性。該細胞株對于高細胞密度很敏感，當細胞超過(guò)70%匯合時(shí)，一些細胞可能會(huì )丟失它們的表型。若細胞密度持續在70%以下，QBI-293A細胞則能連續培養3~4個(gè)月維持原有細胞特性。若以購買(mǎi)得到的293作為第一代，則30代內能得到最佳結果。一旦到了30代，最好復蘇一管細胞開(kāi)始新的培養。所以，我們建議你在收到細胞后應盡快建立自己的QBI-293A細胞庫。

QBI-293A細胞在DMEM培養液中培養，該培養液還含有4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L丙酮酸鈉、2mM谷氨酰胺和胎牛血清。血清濃度為2%~10%，視實(shí)驗需要來(lái)調節細胞生長(cháng)速度。為簡(jiǎn)化此操作說(shuō)明，培養基描述為DMEM后加血清濃度（如：DMEM5%表示：含有4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L丙酮酸鈉、終濃度為2mM的谷氨酰胺和終濃度為5%的熱滅活胎牛血清）。QBI-293A細胞需按標準的細胞培養規程進(jìn)行操作，在健康狀態(tài)時(shí)，它們呈成纖維細胞樣并在培養瓶中貼壁形成單層細胞。被感染的細胞則變圓脫落，即所謂的細胞病理效應（CPE）。所有的細胞培養操作都應嚴格遵循無(wú)菌原則，這一點(diǎn)是至關(guān)重要的�？股�素可用可不用，但無(wú)抗生素條件對于操作質(zhì)量來(lái)說(shuō)通常是一個(gè)好的對照。 

QBI-293A細胞生長(cháng)的相對密度見(jiàn)下表：

表2：匯合率與細胞數量  

匯合率(%) 60mm培養皿 100mm培養皿

50 1.60×106 3.5×106 

75 2.40×106 5.25×106   

100 3.20×106 7.00×106  

 

5.1.1 QBI-293A細胞初始培養 

1. 將凍存的一管QBI-293A細胞在37℃水浴輕輕晃動(dòng)融化。

2. 融化后在超凈臺無(wú)菌條件下用70%乙醇將凍存管的蓋沿擦拭干凈。 

3. 將細胞轉入15mL無(wú)菌離心管中，加入10mL DMEM 10%，600×g離心5分鐘使細胞沉淀。

4. 棄去上清。

5. 將細胞用10mL DMEM 10%重懸，輕輕打勻 

6. 轉入75cm2培養瓶或100mm培養皿中培養。  

7. 在5% CO2孵箱中37℃培養過(guò)夜。 

8. 第二天觀(guān)察細胞匯合率，若合適則可進(jìn)行實(shí)驗，否則按5.1.2所述繼續培養。

5.1.2 QBI-293A細胞的維持培養和增殖 

QBI-293A細胞必須按1:10到1:20傳代

1. 室溫下胰酶消化1~3分鐘使貼壁細胞脫落 

2. 拍打培養瓶邊緣使細胞脫落，在倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞是否變圓，是否已從培養瓶表面脫落。

3. 按需要用新鮮培養液稀釋細胞懸液，轉入新的培養瓶中。在5% FBS中，細胞倍增的時(shí)間是26小時(shí)，在10% FBS中稍短一些。

5.1.3 QBI-293A細胞的凍存

建立細胞庫時(shí)必須使培養的細胞匯合率低于50%，以保證亞克隆的特定表型。

1. QBI-293A細胞必須在含10%高質(zhì)量FBS的DMEM中培養。 

2. 將健康生長(cháng)的QBI-293A細胞離心沉淀。

3. 以最小體積的DMEM 10%重懸細胞。

4. 用血球計數器進(jìn)行細胞計數。 

5. 用DMEM5% + 10% DMSO + 40% FBS重懸細胞，細胞終濃度為1×106/mL。

6. 無(wú)菌操作將1mL細胞懸液轉入2mL凍存管中。 

7. 將凍存管放入凍存盒中，-80℃儲存24小時(shí)。這一簡(jiǎn)便措施可保持約1℃/分鐘的降溫速率，適于凍存細胞。