AdEasyTM重組子轉染QBI-293A細胞

 

  注意：培養細胞前先參閱5.1章中有關(guān)QBI-293A細胞培養的內容。磷酸鈣技術(shù)中的注意點(diǎn)：  

無(wú)菌在整個(gè)過(guò)程中保持所有成分的無(wú)菌是至關(guān)重要的。昆騰公司提供的試劑盒中所有成分均是無(wú)菌的，但使用者還必須保證所用其它試劑也均為無(wú)菌。 DNA純度  磷酸鈣轉染中所用的DNA必須是高純度的，一些DNA污染物對培養的細胞具有很強的毒性，那些成功轉染的細胞往往會(huì )被污染物殺死。沉淀時(shí)間以前的資料都建議磷酸鈣- DNA共沉淀顆粒在加入細胞和培養液之前至少應反應20分鐘。然而與此相反，最近的研究（Jordan等，1996）顯示長(cháng)時(shí)間共沉淀會(huì )形成聚合沉淀塊，從而降低轉染效率。因此，建議共沉淀成分混合后1分鐘即可將沉淀加入細胞培養板。這一時(shí)間上的調整可產(chǎn)生小而穩定的沉淀，能更有效地被細胞攝入。

 

4.4.1 細胞鋪板

每塊板都用DMEM5%進(jìn)行培養，這樣細胞在鋪板后第二天即可達到70%匯合率。由于共轉染是通過(guò)細胞表面完成的，因此轉染時(shí)細胞必須是分離的，而不是匯合的。

 

1． 轉染前一天以7.5×105 QBI-293A細胞在60mm培養皿中鋪板，用DMEM5%培養，第二天的細胞數應達到1.0~1.5×106。37℃ CO2孵箱中培養。CO2孵箱有助于保持合適的PH，培養皿在不進(jìn)行操作時(shí)必須始終保存在CO2孵箱中。

2． 轉染前3-4小時(shí)換成新鮮培養液，以保證在轉染過(guò)程中細胞具有超常的生長(cháng)力。將培養皿放回CO2孵箱中。  

4.4.2 磷酸鈣轉化技術(shù) 

1． 每個(gè)轉染都必須用5ug無(wú)菌的線(xiàn)性化重組腺病毒DNA。

2． 標記一個(gè)1.5ml離心管為編號1。用微量移液槍加入169ul無(wú)菌水和5ul 2M氯化鈣溶液。上下吸打二次混勻，然后一滴一滴加入50ul AdV DNA溶液和26ul 2M氯化鈣，再用移液槍慢慢吹打混勻。此時(shí)緩沖液的體積為250ul，含有0.25M氯化鈣和5ug DNA。

3． 準備第2管離心管（編號2），加入250ul 2×HBS緩沖液。 

4． 用1ml移液槍吹打2號管中的溶液形成氣泡，在吹打的同時(shí)逐滴加入1號管的溶液。加完后繼續吹打5秒以使其完全混勻。這一步驟對于形成的共沉淀顆粒的大小至關(guān)重要，小顆粒轉染效率更高，而吹打可以形成較小的顆粒。等一分鐘后再加入細胞培養皿內。

5． 在超凈臺內將磷酸鈣-DNA共沉淀混合物逐滴加入到培養皿中，覆蓋范圍盡可能廣。培養液稍后即會(huì )透明，十字形晃動(dòng)培養皿使沉淀均勻分布。

6． 培養皿放入孵箱培養過(guò)夜。4小時(shí)后，沉淀顆粒在200×倒置顯微鏡下應清晰可見(jiàn)，尤其在無(wú)細胞的培養皿表面。

7． 第二天，去除含共沉淀顆粒的培養液，用PBS制備的1mM EDTA溶液洗一次，PBS洗2次。注意：轉染后細胞都十分脆弱，容易脫壁。清洗時(shí)應十分輕柔，將PBS沿培養皿壁加入，然后輕輕旋轉培養皿。用移液槍反復將培養液直接加在細胞上，即可使細胞脫落，然后收集。由于這一時(shí)期細胞十分脆弱，切勿使用胰酶消化。