將侯選重組子進(jìn)行酶切分析，驗證其結構。比如：PacI酶切后通常得到約30kb的片段和一個(gè)3.0或4.5kb的小片段。小片段的大小因重組位置在左臂還是復制子而不同。建議同時(shí)用克隆基因的內切酶進(jìn)行分析，鑒定是否含有插入基因。挑選最佳陽(yáng)性重組子轉入DH5α中進(jìn)行擴增：轉化DH5α只需1-5ul小量制備的重組子。這一步對于擴增時(shí)保持重組DNA的結構是必需的，因為AdEasyTM這樣的大質(zhì)粒在recA+細菌株如BJ5183中是不穩定的，會(huì )迅速出現缺失,而在DH5α中能很容易地獲得大量DNA。
1． 將DH5α感受態(tài)細胞和電穿孔杯置于冰上。
2． 將1-5ul DNA加入40ul DH5α感受態(tài)細胞中，DNA必須用水溶，避免含有離子。
3． 將DH5α感受態(tài)細胞轉入2mm電穿孔杯，防止形成氣泡。
4． 按照說(shuō)明轉化DH5α：Bio-Rad儀器一般使用的參數為：200 Ohms、25uF、2.5KV；BTX儀器則為：50 Ohms、2.5KV、C=0。
5． 將轉化混合液重懸于1ml LB中。
6． 轉入15-50ml離心管中，37℃振蕩培養60分鐘。
7． 培養后用LB按一定梯度稀釋轉化的DH5α（1:10、1:100和1:1000）
8． 取100ul轉化液鋪在LB/Kan（50ug/ml）板上，37℃培養24小時(shí)。未用的轉化液可在4℃保存-2周。
9． 每個(gè)重組子挑1~3個(gè)克隆轉入5ml LB擴增，以備有足夠量質(zhì)粒。這時(shí)，用內切酶再次分析重組DNA，以確證含有插入基因，以及重組子的穩定性。
10． 用柱純化試劑盒制備至少5ug高質(zhì)量的重組DNA。
11． 取5ug質(zhì)粒用PacI消化，酚/氯仿抽提一遍，乙醇沉淀后在無(wú)菌條件下溶于50ul 0.1×TE溶液。具體要求參見(jiàn)磷酸鈣技術(shù)一章中有關(guān)轉染前DNA制備的內容。
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