4.2.1 共轉染的一般原則
1） 將線(xiàn)性化轉移載體和pAdEasyTM-1 DNA共轉化BJ5183必須要用高活性的感受態(tài)細胞。試劑盒中提供的細菌為電穿孔感受態(tài)，有很高的轉化效率。如果不用電穿孔法進(jìn)行轉化，那么必須制備化學(xué)敏感性感受態(tài)細胞，并在應用之前試驗其轉化活性（108已足夠）。
2） DH5α不可用于轉化，因其不支持重組，它只是用來(lái)擴增重組病毒DNA。
3） 本實(shí)驗需要2ug線(xiàn)性化膠純化的重組轉移載體，共轉化和對照各需1ug。
4.2.2 共轉化方法
同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗組和對照組的轉化實(shí)驗：
實(shí)驗組共轉化：1ug線(xiàn)性化重組轉移載體（5ul）和1.0ul pAdEasyTM-1載體（100ug/ul）
對照組轉化：1ug（5ul）線(xiàn)性化重組轉移載體 _n YG;lf
1． 將BJ5183感受態(tài)細胞和電穿孔杯置于冰上。將細胞分為2管，每管40ul。
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2． 40ul感受態(tài)細胞中至多加入6ul DNA，且DNA必須溶于水，避免含有離子。
3． 將BJ5183轉入2mm電穿孔杯，防止有氣泡形成。
4． 按電穿孔供應商的使用說(shuō)明轉化BJ5183，Bio-Rad儀器一般使用的參數為：200 Ohms、25uF、2.5KV；BTX儀器則為：5 Ohms、2.5KV、c=3.o
5． 用1mlLB重懸轉化物。
6． 轉入15~50ml離心管中，37℃震蕩培養60分鐘。
7． 將轉化物鋪3~5塊 LB/Kan（50ug/ml）培養板，37℃培養24小時(shí)。建議分別鋪100、300和600ul，以提高至少在一塊板中得到可分離菌落的機率，應該得到40~100個(gè)菌落。
8． 挑出24個(gè)最好的克隆，轉入2ml LB/Kan（50ug/ml）培養液中培養10~15個(gè)小時(shí)。不要儲存BJ5183培養液，因有可能產(chǎn)生非目的重組子。盡快抽提重組AdEasyTM質(zhì)粒.
9． 用傳統堿裂解法小量制備質(zhì)粒，取一半進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳，驗證超螺旋質(zhì)粒的大小。玻璃珠或樹(shù)脂制備質(zhì)粒的試劑盒應避免使用，但粘粒DNA抽提試劑盒可以用。重組質(zhì)粒大小約40kb，由于它是低拷貝質(zhì)粒，所以小量制備時(shí)應相應調整具體操作。
4.2.3 預期結果
20%以上的菌落應含有大質(zhì)粒（近40kb），這些是侯選重組子。與對照培養板生長(cháng)的菌落進(jìn)行對照即可大概估計線(xiàn)性化轉移載體再連接所致的背景強弱。由于在此高效重組recA+細菌中重組轉移載體會(huì )形成多聚體，因此背景將表現為一個(gè)梯度。
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