將基因克隆入AdEasyTM轉移載體

 

  AdEasyTM系統中有2種轉移載體可供進(jìn)行重組腺病毒構建：pShuttle和pShuttle-CMV，這2個(gè)載體都含有多克隆位點(diǎn)（MCS）供插入基因。Shuttle不含有啟動(dòng)子和多聚腺苷酸位點(diǎn)（polyA），允許插入含特定啟動(dòng)子和polyA位點(diǎn)的表達盒。pShuttle-CMV含有單拷貝CMV啟動(dòng)子和polyA位點(diǎn)供基礎表達和高表達重組蛋白，你只需將目的基因插入pShuttle-CMV的多克隆位點(diǎn)。表1提供了各轉移載體的特性。   

表1 AdEasyTM轉移載體特性

載體名稱(chēng) 克隆能力 啟動(dòng)子 polyA位點(diǎn) 克隆位點(diǎn) 線(xiàn)性化位點(diǎn) 說(shuō)明

pShuttle 7.5kb — — MCS 共轉化位點(diǎn)PmeI（ECoRI） 

轉染位點(diǎn)（PacI） 將完整的表達盒裝入多克隆位點(diǎn)（MCS） 

pShuttle-CMV 6.6kb CMV + MCS 共轉化位點(diǎn)PmeI（ECoRI） 

轉染位點(diǎn)（PacI） CMV啟動(dòng)子能在大多數哺乳動(dòng)物細胞中高效表達蛋白

 

4.1.1 克隆的一般原則

AdEasyTM轉移載體的特殊設計使其極易在克隆中應用，但在設計克隆策略時(shí)應考慮以下因素：

1） 在BJ5183中進(jìn)行共轉化之前必須將轉化載體線(xiàn)性化。確證表1中所列的線(xiàn)性化位點(diǎn)不存在于插入的基因中。注意：在pShuttle中用EcoRI線(xiàn)性化時(shí)，需要用RecA輔助的限制性?xún)惹忻高M(jìn)行酶切。如果插入基因含有所有線(xiàn)性化酶切位點(diǎn)，那么必須進(jìn)行定向突變。

2） 重組腺病毒質(zhì)粒在轉染QBI-293A細胞之前也必須用PacI進(jìn)行線(xiàn)性化。同樣，插入基因中不能含有PacI位點(diǎn)，如果有則必須進(jìn)行定向突變。

3） 克隆能力是指質(zhì)粒載體能夠克隆并且不影響病毒增殖能力的插入基因的最大長(cháng)度。各轉移載體的克隆能力見(jiàn)表1，建議插入基因的長(cháng)度最好不超過(guò)它的上限。在pShuttle和pShuttle-CMV中分別插入大于7.5kb和6.6kb的基因將大大降低整個(gè)系統的效率。盡管也可能得到重組子，但可能會(huì )發(fā)生DNA重排，生長(cháng)速度也將減慢。

 

4） 如果要插入多個(gè)表達盒，應避免以頭對頭方向插入相同的元件（如CMV啟動(dòng)子），否則同源重組時(shí)兩個(gè)元件之間的部分可能會(huì )發(fā)生丟失。 

5） 在進(jìn)行構建腺病毒之前最好測定重組蛋白的暫時(shí)性表達。這里沒(méi)有提供詳細的操作方法，但在CMV或其它強力啟動(dòng)子控制下的基因很容易進(jìn)行暫時(shí)性表達實(shí)驗。但某些啟動(dòng)子控制下的蛋白表達水平在無(wú)病毒增殖時(shí)可能不足以達到檢測水平。

 

6） 載體DNA可用氯化銫溴化乙錠平衡密度梯度離心或親和柱法進(jìn)行純化。我們不主張用小量粗制的DNA進(jìn)行轉化和轉染實(shí)驗，因為污染的DNA將大大降低菌落和空斑的形成數。

 

4.1.2 構建重組AdEasyTM轉移載體

構建重組AdEasyTM轉移載體的一般指導如下，但我們建議對于詳細的克隆技術(shù)和操作方法還需參考通用的分子生物學(xué)手冊。 

1． 若cDNA含有位置正確的粘性?xún)惹忻肝稽c(diǎn)，則可將它直接克隆入轉移載體。如果沒(méi)有，可以使用鈍末端內切酶位點(diǎn)，也可用含合適的酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR或連接含有酶切位點(diǎn)的接頭使cDNA產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)。PCR插入酶切位點(diǎn)的方法較快速，但對于長(cháng)cDNA則應使用連接接頭，因為在擴增過(guò)程中Taq酶可能會(huì )使序列的某些位點(diǎn)發(fā)生突變。

2． 插入基因的鑒定可以用限制性?xún)惹忻阜治龌騊CR的方法。

3． 轉化之前用PmeI或EcoRI將轉移載體重組子線(xiàn)性化，消化應盡可能徹底，以減少背景信號。

4． 瓊脂糖凝膠上觀(guān)察消化產(chǎn)物，若消化已完全，放入65℃ 20分鐘進(jìn)行滅活。

5． 凝膠純化線(xiàn)性化載體。盡管膠純化可能會(huì )降低轉化效率，但不完全消化往往產(chǎn)生較高的背景，從而降低重組率。將線(xiàn)性化質(zhì)粒去磷酸化也有助于降低背景信號。