3.1 技術(shù)概覽
AdEasyTM系統是由T.C.He等（1998）構建的用來(lái)代替傳統腺病毒重組系統的一個(gè)快捷系統。在這個(gè)系統中，只需二步即可產(chǎn)生重組腺病毒：先將表達盒裝入轉移載體，然后再通過(guò)同源重組插入腺病毒基因組。將外源基因插入腺病毒的最有效途徑是通過(guò)同源重組，原因是：1）腺病毒DNA是大型的線(xiàn)性分子，含有幾乎所有的內切酶切位點(diǎn)；2）基因組過(guò)大（36kb），難于操作。在A(yíng)dEasyTM載體系統中，含有大部分腺病毒基因組的載體為超螺旋質(zhì)粒，而不是線(xiàn)性DNA，同源重組則在大腸桿菌進(jìn)行。相對于傳統系統而言，這二點(diǎn)改進(jìn)使病毒DNA操作更容易，同時(shí)由于利用了大腸桿菌的高效率同源重組特性而使重組載體的篩選更為簡(jiǎn)單。在本系統中，首先將基因cDNA插入一個(gè)轉移載體，將得到的質(zhì)粒用PmeI線(xiàn)性化，然后在大腸桿菌BJ5183中與病毒DNA質(zhì)粒pAdEasy-1進(jìn)行同源重組。pAdEasy-1缺失了E1和E3區，其E1區功能將在293A細胞中得到互補。重組子通過(guò)卡那霉素篩選，用內切酶進(jìn)行鑒定分析。最后將得到的重組腺病毒用PmeI線(xiàn)性化，暴露其反向末端重復序列（ITR，Iaverted Termined Repeats），轉染QBI-293A細胞后產(chǎn)生重組病毒顆粒。 同源重組在線(xiàn)性化的轉移載體和完整的超螺旋腺病毒質(zhì)粒之間進(jìn)行。應用完整的腺病毒質(zhì)粒而不用內切酶進(jìn)行線(xiàn)性化，對于產(chǎn)生重組腺病毒至關(guān)重要。轉移載體中的卡那霉素抗性基因則可用來(lái)篩選重組子。由于線(xiàn)性化的轉移載體產(chǎn)生卡那霉素抗性克隆的背景較低，因此此同源重組系統有較高的信噪比。大腸桿菌BJ5183有recA活性，但同時(shí)缺失介導細菌重組的其它酶，具有高效的轉化和重組能力。一旦重組子經(jīng)確定，則可轉入普通的無(wú)recA、endA活性的細菌株如DH5α等進(jìn)行擴增。由于缺乏recA活性，DH5α不能用于腺病毒的同源重組。
3.2 Ad EasyTM系統中產(chǎn)生重組腺病毒的時(shí)程 與傳統系統相比，AdEasyTM系統中篩選和純化腺病毒所需的時(shí)間大大縮短了�？寺『秃Y選約需1-3周，重組后需驗證重組病毒質(zhì)粒是否含有目的基因。重組子在DH5α中擴增后轉入哺乳動(dòng)物細胞293A，最后將293A細胞中產(chǎn)生的重組病毒顆粒進(jìn)行純化和滴定。最終得到的重組腺病毒只能在提供E1區功能的293A細胞中進(jìn)行增殖。一般來(lái)說(shuō)，用傳統方法產(chǎn)生重組腺病毒并不需要大量工作，每天只需1小時(shí)進(jìn)行細胞傳代和觀(guān)察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整個(gè)過(guò)程就需要很長(cháng)時(shí)間。而AdEasyTM載體系統用大腸桿菌產(chǎn)生重組病毒，大大縮短了所需時(shí)間。我們強烈建議初學(xué)者用QBI-Infect＋陽(yáng)性對照進(jìn)行感染力測定（見(jiàn)5.2.2）。進(jìn)行這些測定之前，必須先擴增QBI-293A細胞。感染力測定使你能觀(guān)察到病毒增殖導致的細胞表型的改變，獲知你所用細胞對腺病毒的敏感性，而病毒空斑測定可讓你觀(guān)察到病毒空斑的形成。
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