細菌鑒定中常用的生理生化反應

1、實(shí)驗原理

（1）細菌生化試驗
各種細菌所具有的酶系統不盡相同，對營(yíng)養基質(zhì)的分解能力也不一樣，因而代謝產(chǎn)物或多或少地各有區別，可供鑒別細菌之用。用生化試驗的方法檢測細菌對各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，從而鑒別細菌的種屬，稱(chēng)之為細菌的生化反應。

（2）糖（醇）類(lèi)發(fā)酵試驗
不同的細菌含有發(fā)酵不同糖（醇）的酶，因而發(fā)酵糖（醇）的能力各不相同。其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物亦不相同，如有的產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。酸的產(chǎn)生可利用指示劑來(lái)判定。在配制培養基時(shí)預先加入溟甲酚紫［P HS . 2 （黃色）一6 . 8 （紫色）] ，當發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，可使培養基由紫色變?yōu)辄S色。氣體產(chǎn)生可由發(fā)酵管中倒置的杜氏小管中有無(wú)氣泡來(lái)證明。

（3）甲基紅（Methylred ）試驗（該試驗簡(jiǎn)稱(chēng)MR 試驗）

很多細菌，如大腸桿菌等分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再被分解，產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養基的pH 降低到4 . 2 以下，這時(shí)若加甲基紅指示劑呈現紅色。因甲基紅指示劑變色范圍是pH4 . 4 （紅色）一pH6 . 2 （黃色）。若某些細菌如產(chǎn)氣桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，但很快將丙酮酸脫梭，轉化成醇等物，則培養基的pH 仍在6 . 2 以上，故此時(shí)加入甲基紅指示劑，呈現黃色。

（4）大分子物質(zhì)代謝實(shí)驗．

靛基質(zhì)（口引睬）試驗

某些細菌，如大腸桿菌，能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)（叫睬），靛基質(zhì)與對二甲基氨基苯甲醛結合，形成玫瑰色靛基質(zhì)（紅色化合物）。

硫化氫試驗
某些細菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），產(chǎn)生硫化氫，硫化氫與培養基中的鉛鹽或鐵鹽，形成黑色沉淀硫化鉛或硫化鐵。為硫化氫試驗陽(yáng)性，可借以鑒別細菌。

明膠液化實(shí)驗
某些細菌具有膠原酶，使明膠被分解，失去凝固能力，呈現液體狀態(tài)，是為陽(yáng)性。淀粉水解試驗（在紫外誘變中做，本實(shí)驗不做）
細菌對大分子的淀粉不能直接利用，須靠產(chǎn)生的胞外酶（淀粉酶）將淀粉水解為小分子糊精或進(jìn)一步水解為葡萄糖（或麥芽糖），再被細菌吸收利用，細菌水解淀粉的過(guò)程可通過(guò)底物的變化來(lái)證明，即用碘測定不再產(chǎn)生藍色。

（5）有機酸鹽及氨鹽利用試驗

檸檬酸鹽利用試驗
檸檬酸鹽培養基系一綜合性培養基，其中檸檬酸鈉為碳的唯一來(lái)源。而磷酸二氫按是氮的唯一來(lái)源。有的細菌如產(chǎn)氣桿菌，能利用檸檬酸鈉為碳源，因此能在檸檬酸鹽培養基上生長(cháng)，并分解檸檬酸鹽后產(chǎn)生碳酸鹽，使培養基變?yōu)閴A性。此時(shí)培養基中的溟廖香草酚藍指示劑由綠色變?yōu)樯钏{色。不能利用檸檬酸鹽為碳源的細菌，在該培養基上不生長(cháng)，培養基不變色。

2、實(shí)驗儀器，材料和用具
（1）實(shí)驗儀器
37OC 恒溫培養箱、20OC 恒溫培養箱（室溫代替）。

（2）微生物材料
大腸桿菌、變形桿菌、枯草桿菌、產(chǎn)氣桿菌這四種菌種的斜面各1 支。
（3）試劑
甲基紅試劑、V . P 試劑、叫噪試劑、格里斯試劑（硝酸鹽利用試驗）、盧戈氏碘液（淀粉水解試驗）

（4）實(shí)驗用具
試管：每份每個(gè)試驗2 根試驗，1 根對照，8 個(gè)試驗共27 根。
無(wú)菌乎皿：每份2 個(gè)
杜氏小管：每份6 個(gè)。
接種環(huán)、酒精燈、試管架、記號筆。

（5）培養基
葡萄糖發(fā)酵培養基和乳糖發(fā)酵培養基：何份各6 支試管，何支5 一10mi 培養基，滅菌。用于糖類(lèi)發(fā)酵試驗。
葡萄糖蛋白陳水培養基：每份3 支試管，何支5 一10mi 培養基，滅菌。用于甲基紅和V . P 試驗。
胰蛋白水培養基：每份3 支何支5 一10mi 培養基，滅菌。用于叫睬試驗。
檸檬酸鐵錢(qián)或醋酸鉛的半固體培養基；每份3 支，每支5 一10ml 培養基，滅菌。用于硫化氫試驗。
營(yíng)養明膠培養基：每份3 支，每支．5 一10ml 培養基、滅菌。用于明膠液化試驗。
淀粉培養基：每份2 個(gè)平皿，每平皿約20ml 培養基，滅菌后倒入平皿。用于淀粉水解試驗。
檸檬酸鈉培養基：每份3 支，每支5 一IOml 培養基，滅菌，做斜面。用于檸檬酸鹽利用試驗。

3、實(shí)驗步驟

（1）糖（醇）類(lèi)發(fā)酵試驗
編號在各試管上分別標明發(fā)酵培養基名稱(chēng)，所接種的菌名和組號，下同。
接種取葡萄糖發(fā)酵培養基3 支，按編號1 支接種大腸桿菌，另1 支接種普通變形桿菌，第3 支不接種，作為對照C 同樣取3 支乳糖發(fā)酵培養基，1 支接種大腸桿菌，1 支接科普通變形桿菌，第3 支不接種，作為對照。
將己接種好的培養基置37OC 溫箱中培養24h 。
觀(guān)察結果：被檢細菌若能發(fā)酵培養基中的糖時(shí)，則使培養基的pH 降低，這時(shí)培養基中的指示劑呈酸性反應（為黃色），若發(fā)酵培養基中的糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則培養基不僅顯酸色反應，并且在培養基中倒置的小玻璃管（杜氏小管）中有氣體。氣體占整個(gè)倒置小玻管的10 ％以上。若被檢細菌不分解培養基中的糖，則培養基不發(fā)生變化。

（2）甲基紅試驗（MR 試驗）
將大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌分別接種到葡萄糖蛋白陳水培養基中，37OC 培養48h ，加甲基紅指示劑數滴，觀(guān)察結果，呈現紅色者為陽(yáng)性，呈現黃色者為陰性。
（3）伏一普二氏試驗（V . P ．試驗）
將被檢菌接種到葡萄糖蛋白陳水培養基中，37OC 培養48h ，取出，加入40 % KOlls 一10 滴，然后再加入等量的5 ％。一蔡酚溶液，用力振蕩，再放入37OC 溫箱中保溫巧一30min ，以加快反應速度。若培養物呈現紅色，為伏一普反應陽(yáng)性。

（4）靛基質(zhì)（口引噪）試驗將被檢菌接種到胰蛋白陳水培養基中，37OC 培養24h 一48h 后，沿試管壁滴加數滴叫睬試劑于培養物液面，觀(guān)察結果。
出現紅色者為陽(yáng)性，出現黃色者為陰性。

（5）硫化氫試驗：

將大腸桿菌和變形桿菌以接種針穿刺接種到醋酸鉛或檸檬酸鐵氨培養基中，37OC 培養24h ，觀(guān)察結果，若有黑色出現者為陽(yáng)性。

（6）明膠液化試驗
取大腸桿菌和枯草桿菌的純培養物少許，以接種針?lè )謩e穿刺接種到營(yíng)養明膠培養基中，置20OC 培養5 一7 天。觀(guān)察明膠培養基液化情況。若被檢細菌20 OC 不易生長(cháng)，可放3 7 OC 培養，但在此溫度下明膠培養基呈液狀，故觀(guān)察結果時(shí)，應將明膠培養基輕輕放入4OC 冰箱30min ，此時(shí)明膠又凝固。若放置于冰箱30min 仍不凝固者，說(shuō)明明膠被試驗細菌液化，是為陽(yáng)性。

（7）淀粉水解試驗
將配制好的淀粉培養基冷卻到SOOC 左右，以無(wú)菌操作制成平板。
用接種環(huán)取少許枯草桿菌劃線(xiàn)接種在平板的一邊，再取少許大腸桿菌劃線(xiàn)接種在平板的另一邊。置37OC 溫箱培養24h 。
將平皿取出，打開(kāi)皿蓋，滴加少量盧戈氏碘液于平板上，輕輕搖動(dòng)平皿，使碘液均勻鋪滿(mǎn)整個(gè)平板。如菌苔周?chē)�有無(wú)色透明圈出現，說(shuō)明淀粉己被水解。透明圈的大小，說(shuō)明該菌水解淀粉能力的大小。

（8）檸檬酸鹽利用試驗

取少量被檢菌接種到檸檬酸鹽培養基上，37OC 培養24h 后，觀(guān)察結果。培養基變深藍色者為陽(yáng)性。培養基不變色，則繼續培養7 天，培養基仍不變色者為陰性。